德国牧羊犬精液4℃保存体系的建立

赵 禹 张文才 李向党 张汇东

一、德国牧羊犬繁育工作现状

德国牧羊犬由于其优秀的工作能力及威武出众的外貌特征，在我国警用犬种中一直占有较大比例，在犬种实际的繁殖工作中，遇到的问题也较多。如公犬性欲较低，不爬跨；母犬生殖道异常，不能完成自然交配等。

在育种工作中，目前国内德国牧羊犬的育种工作尚未有效的开展。社会养犬业薄弱，选育犬方式也不是以工作性能为主。而警犬基地一般各自开展选育工作，尽管有些警犬基地遵循开放式核心群育种体系，但引种有限，导致优秀血系不能有效拓展，近亲现象较为严重，工作性能退化较为严重。这导致我国警方使用的德国牧羊犬一直在“引种——维持——退化——再引种”的怪圈中循环。而且，从外部环境来看，德国牧羊犬产地德国的德国牧羊犬协会（SV），由于近些年来育种目标逐渐倾向外貌性状选择，而弱化了德国牧羊犬工作性能的培育，使得德国本土的德国牧羊犬工作性能出现了退化的趋势。同样，遵循SV协会选种标准的欧洲其他国家的德国牧羊犬也出现了工作性能退化的趋势。针对这一现状，公安部沈阳警犬基地近年来有计划有步骤的开展起沈阳片区德国牧羊犬联合育种工作，目的就是尽可能搜集整合片区内优秀血系的德国牧羊犬种犬，发挥其最大价值，向同一个育种目标发展，为我国警方提供充足的工作性能优秀的德国牧羊犬犬源。

二、人工授精技术的优势

犬的人工授精技术在犬繁殖工作中具有很多独特优点。如：可以使不能完成自然交配的母犬受孕而获得后代；预防公母犬直接性接触而传播的疾病；可以对精液质量评估增加受孕率；能够省去母犬饲养者因配种而带来的长途旅行的花费和不便；通过冷冻精液技术, 长期保存优良公犬的遗传物质等。

将犬的人工授精技术应用于德国牧羊犬的繁育工作中同样具有现实意义。如：使性欲较低的优秀公犬及不能自然交配的母犬获得后代；人工授精技术是性别控制技术的基础，通过流式细胞仪将X、Y精子分离后进行人工授精，可以获得预定性别的后代；犬人工授精技术是开展警犬联合育种工作的技术基础，可以提高警犬联合育种工作的效率。

而犬精液的保存技术是成功开展犬人工授精工作的重点和难点。目前，国际上通常采用精液冷藏（4℃）及精液液氮冷冻（-196℃）两种方式保存精液。其中，精液4℃冷藏保存方法由于不需像液氮冷冻保存时经过精子细胞的冰晶期，对精子细胞造成的损伤较小，短期保存一段时间后精子质量较好，使用阴道输精方式就可以获得较高的受孕率，操作上相对简单，易于掌握，成本较低，在犬人工授精中具有一定的应用价值。国外养犬发达国家已将此技术应用于犬的实际繁殖工作中，特别适用于短途犬精液的运输，一般2～3天内到达后即进行人工授精，母犬妊娠率与自然交配妊娠率相当。相对于液氮冷冻保存唯一缺点是不能长期保存。而国内尚未见犬精液4℃冷藏保存用于人工授精的报道。

三、德国牧羊犬精液4℃保存体系的建立

下面将德国牧羊犬精液4℃保存整个实验步骤简述如下。

（一）采精前准备

公犬精液采集在清洁、安静的场地或公犬圈内进行。每条公犬由所熟悉的人站立保定，为防意外可给犬戴上口笼。用0.1%的高锰酸钾溶液清洗公犬阴茎部。

（二）精液的采集与分析

采用手握按摩法采精，按摩的速度和压力可根据不同的公犬确定，一般情况下经过1～2min的按摩，公犬的阴茎就可充分勃起并射精，采集公犬中段富含精子的精液，采精量一般在2ml以上。

采集精液后，立即观察精液的气味和色泽，乳白色或淡乳白色者为正常精液，用伟力精液检测分析系统分析精液质量参数，精子活力大于0.8，活率大于90%的用于接下来的实验研究。

（三）精液的处理

将采集的犬精液装入离心管中离心8分钟，移去上清液，使用不同实验设计的稀释液2倍稀释，密度在0.5×108个/ml以上，放于4℃冰箱内保存。分别于12h、24h、36h、48h后使用精子检测分析系统分析比较各组稀释液的保存效果，确定最佳稀释液配方。

（四）精液稀释液的研究配制

本实验以国内外常用犬精液低温保存的卵黄-Tris稀释液为基础，比较了不同浓度的葡萄糖与果糖对德国牧羊犬精液4℃保存效果的影响；同时研究了不同浓度的VE、还原性谷胱甘肽等抗氧化剂对德国牧羊犬精液4℃保存效果的影响。获得了适宜德国牧羊犬精液4℃保存的稳定的稀释液配方，使德国牧羊犬精液4℃保存48h后精子质量仍然较高，精子活力0.7以上，活率达到80%以上。

（五）人工授精

将于4℃保存48h的德国牧羊犬精液放于37℃水域锅中1min，使用注射器将精液吸于注射器内，将输精管插于适宜配种的发情母犬阴道内，将注射器内的犬精液注入母犬体内，之后将母犬后肢抬高，按摩母犬外阴部1～2min，完成输精过程。

犬精液4℃保存体系的建立重点在于犬精液稀释液的配制。本实验研究以国外犬精液低温保存稀释液配方为基础，对其进行了一定优化，用于德国牧羊犬精液4℃保存。实验获得了稳定可靠的德国牧羊犬精液4℃保存稀释液配方，使德国牧羊犬精液4℃保存48h后精子质量仍然较高（精子活力0.7以上，活率80%以上），完全满足人工授精需要，可以用于开展人工授精工作。实验选取4头发情母犬用于人工授精对象，将实验中4℃保存48h的德国牧羊犬精液采用阴道输精法输入发情母犬体内，其中3头母犬妊娠产仔，妊娠率达75%，平均窝产仔数7头，仔犬发育良好。这一结果初步证明4℃保存德国牧羊犬精液一段时间后可以取得较高的母犬妊娠率及窝产仔数。同时，这一时间内，几乎可以实现沈阳片区内任意两个地区的运输，从而实现人工授精技术在沈阳片区德国牧羊犬联合育种中的应用，促进沈阳片区德国牧羊犬联合育种工作的开展。