CyclinA2基因5′－UTR多态性与结直肠癌遗传易感性的关系

王 琦，黄 俊△，邱 强，黄明文，周诚亮

（1.南昌大学第二附属医院胃肠外科，南昌 330006；2.江西省奉新县中医院普外科，奉新 330700）

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内占恶性肿瘤的第3位［1］，近年来，随着人民生活方式及饮食习惯的改变，我国已进入结直肠癌的高发地区行列，并以年均4%的增幅不断攀升，已经接近西方发达国家的水平［2］。结直肠癌的发生、发展不仅与遗传和环境有关，而且也是一个多基因变化、多阶段发展的过程。近年来，随着对细胞分子生物学的不断研究，人们已逐步认识到，细胞周期的调控异常与肿瘤的发生有着密切的关系，细胞周期调节紊乱易使细胞异常增殖，一旦增殖和凋亡的平衡被打破，便导致了肿瘤的发生。细胞周期素A2（CyclinA2）即通常所说的CyclinA，在细胞周期进程中起正性调控作用。目前，国内外均有研究表明，CyclinA2的高表达与结直肠癌的发生、发展有关［3－4］，但具体的分子机制还不清楚。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，有研究表明，位于启动子区域的SNP通常对疾病的发生、发展会产生重大影响。最近国外有研究发现，CyclinA2基因5′－UTR区rs769236位点G＞A多态性与结直肠癌的易感性有关联［5］，但到目前为止，尚无关于CyclinA2 rs769236位点G＞A多态性与结直肠癌发病风险的相关性的报道。本文将重点讨论CyclinA2基因5′－UTR区rs769236位点G＞A多态性与结直肠癌易感性之间的关系，为结直肠癌的早期诊断、治疗及判断预后提供新的思路和手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例组选自2012年1～9月在南昌大学第二附属医院确诊为结直肠癌的患者，共150例，排除家族性腺瘤性息肉病和遗传性结直肠癌；对照组为同一时期来本院健康体检的人群，均证实为身体健康，共150例。病例组和对照组无年龄、性别的限制，并证实均为无亲缘关系的汉族人口；正常对照按年龄（±5岁）、性别等方面与病例频数匹配。研究对象签署知情同意书后，采用统一的流行病学调查问卷，收集整理结直肠癌组和健康对照组临床病理资料，记录年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤家族史等情况。吸烟、饮酒史：参照国际惯例，既往吸烟累计少于100支烟者定义为不吸烟者，超过100支者为吸烟者；1周至少饮酒1次、累计时间1年以上者定义为有饮酒史，没达到这一标准为不饮酒者。肿瘤家族史：一级亲属和／或二级亲属患有癌症者定义为有癌症家族史，否则就定义为无。分别抽取病例组和健康对照组清晨外周静脉血2mL，EDTANa抗凝，用于PCR检测。

1.2 PCR－RFLP技术检测cyclinA2基因型

1.2.1 DNA提取 采用DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术公司），提取每份抗凝外周血的总DNA，操作均按说明书进行，将提取好的DNA溶解于pH8.0TE中，－20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 PCR（PCR试剂购自Takara公司）扩增含有rs769236（G＞A）位点的片段：上游引物5′－CGC TCA CTA GGT GGC TCA G－3′和下游5′－CCG AGG AGG TTG CGA AAG G－3′（南京金斯瑞生物科技有限公司合成）。PCR反应在20μL体系中进行，反应条件：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

1.2.3 PCR产物凝胶回收 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收，操作均按琼脂糖凝胶回收试剂盒（Promega公司）说明书进行操作。

1.2.4 酶切反应 建立20μL酶切反应体系，其中双蒸水10μL，缓冲液2μL，PCR回收产物7μL，BglⅠ内切酶（Fermentas公司）1μL，37℃恒温2h，酶切产物以含溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统成像。PCR扩增片段为342bp，GG基因型能被BglⅠ内切酶酶切产生2个片段（259bp、83bp），杂合子 GA基因型则产生3个片段（342bp、259bp和83bp），AA基因型只产生1个片段（342bp）。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用χ2检验比较结直肠癌组和对照组的人口学数据、基因型以及等位基因频数分布。以单因素和多因素logistic回归计算比值比（OR）及其95%可信区限（95%CI），分析各基因型与结直肠癌发病风险的关系。以拟合优度χ2检验计算SNP位点各基因型在对照组中的分布是否符合哈迪－温伯格遗传平衡定律（HWE）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况比较 结直肠癌组和对照组比较，年龄、性别、吸烟、饮酒分布差异无统计学意义（P＞0.05）；有肿瘤家族史者在两组间分布差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 结直肠癌组和对照组一般情况的比较［n（%）］

2.2 CyclinA2基因多态性与结直肠癌易感性的关系 对照组中CyclinA2基因rs769236（5′－UTR G＞A）各基因型分布频率频率符合 HWE定律（χ2＝3.14，P＝0.08）。Logistic回归分析，rs769236G＞A突变基因型（GA＋AA）者患结直肠癌的风险显著高于rs769236GG野生基因型的个体（校正OR＝1.92，95%CI＝1.10～3.36），见表2。

2.3 分层分析 按年龄、性别、吸烟、饮酒史和肿瘤家族史进一步分层分析，结果发现CyclinA2基因rs769236位点多态性与结直肠癌发病风险之间的关联在无肿瘤家族史组中的作用更为明显（OR＝2.01，95%CI＝1.10～3.65，P＝0.023），其他组别中，差异无统计学意义，见表3。

表2 CyclinA2基因多态性与结直肠癌发病风险［n（%）］

表3 rs769236多态性与结直肠癌易感性的分层分析

3 讨 论

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生机制仍未完全阐明。目前研究发现，细胞周期的调控异常使一些正常细胞异常增殖并逃避机体免疫系统监视而异常存活在结直肠癌的发生和发展中可能起重要作用。细胞周期的运行主要是由细胞周期素（cyclin）、细胞周期素依赖性激酶（Cyclin－dependent kinase，CDK）和细胞周期素依赖性激酶抑制剂（cyclin－dependent kinase inhibitor，CKI）所调控的。Cyclin可时相性激活相应的CDK，以cyclin－CDK复合物形式磷酸化一系列靶蛋白，调节细胞周期的运转；而CKI即可与cyclin－CDK复合物结合，也可与CDK单独结合而发挥抑制作用。CyclinA2基因定位于人类染色体4q27上，编码产生含432个氨基酸的CyclinA2蛋白，于G1晚期开始合成，其含量在S期逐渐增加，并于G2／M期达到高峰，在M中后期降解。CyclinA2在细胞周期调控中起重要的作用，可分别与CDK1和CDK2结合，不仅可以促进细胞周期的转换（当与CDK2相结合时可促进G1／S期检查点的转换，当与CDK1结合时则可促进G2／M期检查点的转化），而且还具有调节DNA合成和促进细胞有丝分裂的双重作用［6］。

CyclinA2不仅在结直肠癌组织中表达明显上调，而且在非小细胞肺癌、乳腺癌［7］、胃癌［8］、白血病等多种恶性肿瘤中也存在高表达，并与这些肿瘤的预后、分期及复发密切相关。CyclinA2基因转录异常是CyclinA2在肿瘤组织中异常高表达的重要机制，有研究表明，位于基因启动子区域的SNP通常能影响基因的表达或酶的活性［9］。最近一项韩国人群的病例对照研究发现，CyclinA2基因rs769236G＞A多态性位点位于转录起始点（＋1G＞A），＋1A变异等位基因通过改变核心启动子特异序列影响转录因子TFⅡD与核心启动子结合从而上调CyclinA2表达。他们还发现AA基因型可明显增加结直肠癌的发病风险（校正OR＝1.67，95%CI＝1.12～2.49），并通过荧光素酶报告实验证实含有＋1A变异等位基因的启动子转录活性明显提高［5］。与上述研究类似，作者研究也发现CyclinA2基因＋1G＞A突变基因型（GA＋AA）结直肠癌发风险显著增高（校正OR＝1.92，95%CI＝1.10～3.36），推测＋1A变异等位基因通过促进转录因子TFⅡD与核心启动子结合上调CyclinA2表达，促进细胞加速通过G1／S及G2／M期检查点导致细胞周期调控异常，细胞异常增殖，从而增加对结直肠癌的遗传易感性［10］。但在胃癌及乳腺癌中CyclinA2基因＋1G＞A多态性与肿瘤发病风险无明显相关［5］，这可能与不同肿瘤的致癌机制具有组织特异性或样本例数太少有关。另外通过分层分析还发现，相对于有肿瘤家族史者而言，无肿瘤家族史的组别中这种致病作用更为明显，这提示＋1A变异等位基因可能是一种致癌因素。

综上所述，CyclinA2rs769236突变基因型（GA＋AA）是人群罹患结直肠癌的独立危险因素，可作为CRC发病风险的筛选指标。当然由于本研究的样本量偏小，可能存在一定的选择偏倚，作者将继续扩大样本量并在不同族群中进行抽样，进一步研究CyclinA2基因rs769236多态性位点在结直肠癌中发生、发展的具体作用机制，为结直肠癌的早期诊断、治疗及判断预后提供新的理论依据，为基因治疗提供新的靶点。

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