血液免疫学指标在过敏性紫癜大鼠和兔模型及患儿体内的比较

李彦红，黄 澜，朱 华，徐艳峰，隋小龙，徐玉环，韩云林，冯晓纯，秦 川

(1.中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021； 2.长春中医药大学附属医院，长春 130021)

过敏性紫癜(henoch-schonlei purpura，HSP)是一种由IgA免疫复合物沉积介导的小血管炎症性疾病。它是最常见的儿童血管炎性疾病，据报道每年的发病率为6.1～26.5/100 000[1-2]。它的病因学不完全清楚，但是暴露于很多抗原如感染性物质、疫苗及药物很可能会激发免疫学改变[3-4]。诊断主要是依据非血小板减少性紫癜的出现，且紫癜的部位主要位于四肢末端和臀部。其中胃肠道损伤大约占据患者1/2～2/3，其它的临床症状包括关节痛或关节炎、软组织肿胀、血尿或蛋白尿等[5]。结合过敏性紫癜患者病理改变和实验室发现的急性期小血管壁IgA沉积，多核中性粒细胞在血管周围浸润，血清IgA和促炎细胞因子水平增多，因此该病被认为是一种特定的免疫介导的疾病[5]。该病复发率高，病程迁延，并发症多，临床多采用支持治疗，对最严重的过敏性紫癜性肾炎(henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN)目前仍无满意治疗效果[6]。本文通过对构建的过敏性紫癜大鼠和兔模型及患者血液免疫学指标的检测，比较指标的改变情况及异同，从而更好的依靠模型为人类疾病机制探讨、诊断及治疗提供帮助。

1 方法和材料

1.1 实验动物和临床标本

1.1.1 SD大鼠和新西兰大耳白兔

4周龄SD大鼠，体重75～95 g，22只，模型组和对照组，每组雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2012-0001)；1.5月龄日本大耳白兔28只，体重1.2～1.4 kg，18只雌雄各半为模型组，10只雌雄各半为对照组，北京芳元缘养殖场提供(SCXK(京)2009-0014)。动物饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所SPF级动物房(SYXK(京)2011-0022)，实验操作已经过实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准(许可证号：ILAS-PL-2012-005)。

1.1.2 人的标本

患者系长春中医药大学附属医院儿科住院儿童，4～12岁，多为住院2～5 d时采集的血液标本。患者全血及血清12份，对照全血及血清10份，这些患者主要表现为皮肤明显的对称性紫癜，主要在双下肢，有的可见蛋白尿、血尿。对照血清多采自本院即将康复出院且无并发症表现的儿童。

1.2 模型的构建

干姜、荜茇、胡椒水煎剂购自中医药大学北京东直门医院，1∶1∶1的比例混合配成终浓度15 g/100 mL的水溶液，模型组兔口服给药，每次1 mL，模型大鼠灌胃给药，每次0.5 mL，1次/日， 对照组分别给以等量生理盐水，其他条件相同。用药3 周，模型组兔腹腔注射含卵白蛋白(F5503, Sigma)10 mg的生理盐水0.5 mL与弗氏完全佐剂(F5881，Sigma)以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，大鼠注射0.5 mL，1次/周，连续3 周。对照组分别腹腔注射等量的生理盐水。之后，模型组兔耳缘静脉注射10 mg/mL的卵白蛋白生理盐水0.5 mL，模型大鼠尾静脉注射0.25 mL，同时大鼠和兔的背部皮肤剪毛，皮内注射0.3%卵白蛋白生理盐水1 mL，分5点注射，每点0.2 mL。对照组分别以同样剂量和方法给以等量生理盐水。之后观察皮肤红肿状况，照相存档。

1.3 过敏性紫癜大鼠和兔模型的症状特点

抗原激发后，24 h内观察模型组大鼠和兔的背部皮肤水肿，瘀斑的大小、分布、症状出现的比例及随时间改变情况。

1.4 血液学指标检测

抗原激发后24 h内，取大鼠和兔血，测大鼠、兔和人血常规(Rayto RT-7600S,USA)；1 000 r/min离心，取上清，放射免疫法检测大鼠细胞因子IL-2,TNF-α (XH-6020γ-免疫计数器，China)；ELISA测细胞因子IL-4(KB2731,酶标仪ST-360,China)，流式细胞术方法检测白细胞表面标记分子CD4(11-0040-82,eBioscience,USA),CD8(11-0084-82,eBioscience,USA)；用流式细胞仪 (BECTON DICKINSON FACSCalibur, USA)；免疫比浊法(HITACHI.7080, Japan)检测血清IgA,IgE,IgG,C3,C4的含量。

ELISA方法检测兔细胞因子IL-2 (CSB-E08745Rb,Cusabio,USA),TNF-α (CSB-E06998Rb,Cusabio,China)及白细胞表面标记分子CD3 (RTC0247,NeoBiolab,USA),CD4 (CSB-E12791Rb,Cusabio, China)，CD8 (CSB-E12790Rb,Cusabio,China)等，免疫比浊法检测兔血清IgA,IgE,IgG,C3,C4的含量。

ELISA方法检测患者血清免疫细胞表面标记分子CD3(BH5632,China),CD4 (BH1061,China),CD8(KA0133,China)，细胞因子IL-2(HE0064,China)，TNF-α (BH1105,China), IL-4(HE0060,China)；免疫比浊法检测免疫球蛋白IgA,IgE,IgG及补体C3,C4的含量。

1.5 统计学分析

2 实验结果

2.1 症状表现

大鼠和兔子在抗原激发后，24 h内均出现不同程度的出血斑点，大鼠的出血斑点在6～8 h出现，16～18 h后逐渐增多，弥散分布，直径1 mm大小，周围无红肿渗出，出血斑点出现的比例大约为40%(4/10)；兔子的出血斑点在6～8 h出现，并逐渐增大，周围有红肿，14～18 h呈多个片状紫斑，形状不规则，直径多在1 cm左右，少数有渗出，出血斑块出现的比例约为85%(24/28)(封3图1)。两种模型动物出血斑在24 h后逐渐结痂坏死，2周后逐渐缓解，3周明显好转。

2.2 模型病理改变

模型大鼠和兔组织切片HE染色，光镜下发现模型组大鼠和兔均出现不同程度的皮下出血，真皮水肿，血管扩张充血、出血，炎细胞浸润；肾小球囊腔蛋白渗出物，血管扩张充血出血等；还可见到关节腔淤血，结缔组织坏死，炎细胞浸润等；胃黏膜可见出血，上皮细胞坏死脱落；小肠绒毛血管扩张充血，上皮细胞脱落；肺肝淤血，灶性炎细胞浸润；还有少量大鼠和兔脑膜血管扩张充血，炎细胞浸润等等。(封3图2)

2.3 血液学指标

2.3.1 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血常规检测结果

模型组大鼠急性期血常规白细胞(WBC)升高，淋巴细胞(LYM)减少，中性粒细胞(Gran)升高(P<0.05)，淋巴细胞百分比(LYMPH%)减少，粒细胞百分比(Gran%)升高(P<0.01)，血小板(PLT)无明显改变(图3A)；模型兔WBC, Gran, 嗜酸性粒细胞(EOS)升高(P<0.05)，LYMPH%减少(P<0.01)，Gran%和嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)升高(P<0.05)，PLT无明显改变(图3B)；患者(n=10)35%WBC升高，10%LYMPH下降，20%Gran升高，20%LYM%下降，30%Gran%升高，PLT无明显改变。

2.3.2 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血清免疫球蛋白及补体检测结果

模型组大鼠血清免疫球蛋白IgA升高(P<0.05)，IgG升高(P<0.01)，补体C3，C4减少(P<0.05)，IgE无明显改变(图3C)；模型组兔血清IgA升高，IgG降低(P<0.05)，C3，C4减少(P<0.01)，IgE无明显改变(图3D)；患者(n=10)血清IgA， IgE升高(P<0.01)，IgG升高(P<0.05)，C3，C4减少(P<0.05)(图3E)

2.3.3 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血免疫细胞及细胞因子检测结果

模型组大鼠、兔及患者血均有CD4百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差别均具有统计学意义；模型大鼠和兔CD8%升高(P<0.05)，患者体内CD8%无明显差异；模型组兔和患者体内IL-2水平下降(P<0.05)，模型大鼠体内IL-2水平无差异。(表1,2,3)

3 讨论

过敏性紫癜大鼠和兔模型在表型上基本都出现了出血斑点的症状，但大小和程度不同，大鼠的皮肤斑点呈现弥漫形分布，直径2 mm左右，周围未见红肿。兔的皮肤出血斑点大，直径大多在1 cm左右，还有融合斑点，周围红肿。两种模型在皮肤症状出现的时间上大致相同，在激发后6～8 h后开始出现反应，14～18 h后基本出现明显症状。大鼠出现症状的比例不如兔子的高。所有的过敏性紫癜患者形成非瘙痒性皮疹，开始是短暂的红斑丘疹或荨麻疹样水疱，之后成熟呈片状出血斑和紫癜[7]，直径最大超过10 mm，并可形成明显的瘀斑，颜色从红色到紫色，最后到铁锈色直至褪去大概需要几天或几周[8]。大鼠和兔子模型在病理上有相似的改变，均出现关节结缔组织炎症、胃肠道粘膜损伤，出血、肾小球囊腔渗出物，血管扩张淤血等病变。75%的患者有关节炎症状，包括热、肿胀、质地软，该症状是短暂的，不会产生畸形，15%～25%的患者可在紫癜出现前先出现关节症状[9-10]。60%～65%的患者可形成急性腹痛，约30%的患者出现呕吐和胃肠道出血[11]。肾脏疾病是最严重的后遗症，虽然该病的死亡者很少，但肾脏疾病是导致死亡的主要原因[12]。综上，两种模型症状及病理改变与人类疾病相似，可为人类疾病研究提供帮助。

注：A 大鼠血常规结果B兔血常规结果C大鼠血免疫球蛋白和补体结果 D兔血免疫球蛋白和补体结果 E患儿血免疫球蛋白和补体结果(注：*P<0.05,#P<0.01，同对照组相比)。

表1 大鼠免疫细胞及细胞因子检测

表2 兔血清免疫细胞及细胞因子检测

表3 患者免疫细胞及细胞因子检测

大鼠和兔模型急性期血常规都有WBC,NEU数目不同程度的增多，LYM减少，患者血常规检测，虽也有WBC，NEU细胞数目增多，LYM细胞数目减少，但这种改变是散在的，不确定性的，大鼠、兔模型和患者血中都不存在LTP数目的明显改变。模型大鼠、兔和患儿血清急性期存在不同程度的CD3含量下降，CD4%减少，CD8%增加，CD4/CD8比值下降，血清细胞因子IL-4，TNF-α水平增加，但在大鼠血清IL-2水平改变没有差异，兔子血清IL-2水平下降，患儿血清IL-2水平增加。Wiercinaski[13]等在对HSP 急性期患儿外周血 T 淋巴细胞亚群检测中发现CD4+T数量降低， CD8+T数量增高，CD4/CD8比值降低。该研究与我们的研究结果一致。有报道，HSP患者血清IL-4水平升高，IL-2水平降低[14]，该结果与兔模型的研究结果一致。研究表明过敏性紫癜肾炎患者IL-2水平降低，HSP急性期IL-2受体数目和功能较正常者升高和增强，与疾病的活动性相关[15]。该结果与本文患者研究结果相似，说明IL-2水平的改变没有统一的结果。Besbas等[16]报道HSP患者急性期血清促炎细胞因子TNF-α的水平明显增加，该报道与本文大鼠、兔及人的研究结果一致。因此HSP发病机制与T细胞功能改变密切相关。大鼠、兔、患者血清急性期IgA水平均增加，C3,C4水平均下降，但大鼠急性期IgE水平没有明显改变，IgG水平增加，兔急性期IgE没有明显改变，IgG水平减少，患者急性期血IgE, IgG水平均增加。HSP被认为是一种IgA免疫复合物介导的疾病[17]，IgA复合物沉积在皮肤、小肠及肾小球等部位激发局部的炎症应答。目前报道超过一半的HSP病人血清IgA水平增加[9,18-19]。该报道与本文大鼠和兔模型及患者的检测结果一致。Levy等[20]报道18.7%的HSP患者血清C4水平下降，Smith等[21]也报道8%的HSP患者血清C4水平下降，Islek等[22]报道的HSP患者中8%血清C3下降。这些结果与本文的检测结果血清C3,C4均有不同程度的下降相似。HSP患者，C3,C4在组织损伤部位活性增强，但它们的血清水平与疾病的严重性不相关[23]。患者血清IgG, IgE水平文献报道不完全一致，有报道IgG减少，增加或无明显改变，IgE水平增加或无明显改变[24-26]。普遍认为血清免疫球蛋白的失衡，主要增加肾脏受累的机会。Kondo[27]对HSP 患者 IgA 升高机制的研究发现活动性HSP，IgA分泌细胞的均值达正常的2倍, 其敏感性为95.7%， 特异性为90.9%[27]。可见，IgA是参与HSP发病机制的主要免疫球蛋白，其诊断对疾病的诊断具有重要意义。

综上，过敏性紫癜两种动物模型，发病症状、病理及免疫相关指标改变与人类疾病发病均相似，但相对而言，兔模型操作方便，发病稳定，体型大容易观察。两种模型可为该病机制研究和药物筛选评价提供更多的研究途径，也可根据需要选择相应模型。

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