阿奇霉素对斑马鱼心脏毒性的初步研究

崔国祯，周鹤峰，陈焕娴，李铭源

(1.遵义医学院珠海校区 生物工程系，广东 珠海 519041;2.澳门大学 中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室，澳门 999078)

阿奇霉素是第1个氮杂内酯类抗生素，是一较新的广谱大环内酯类抗生素。1980年，南斯拉夫药厂普利瓦(Pliva)成功研发阿奇霉素，并于1981年获批上市。美国辉瑞公司(Pfizer)得到全球开发权后，将其推向全球市场，使用广泛。阿奇霉素抗菌谱广，抗菌活性较好，并具有良好的药代动力学特性(半衰期较长，每天仅需服药1次)，是目前我国临床抗细菌感染的主流药物之一。阿奇霉素在早期的使用过程中，一般认为其相对心脏毒副作用小[1]。然而, 近10年来，越来越多的临床数据提示，阿奇霉素有潜在的心脏毒副作用的风险。早期的个案临床心脏毒性报道主要表现为心脏QT间期延长而发生心律失常，尤其是可发生尖端扭转型室性心动过速的危险[2]，但未引起医药界的广泛关注。直到2012年，《新英格兰医学杂志》刊发的一项美国临床研究表明，服用阿奇霉素显著增加了患者心血管死亡和心脏性猝死的风险[1]，该报道为阿奇霉素的安全使用敲响了警钟。鉴于阿奇霉素存在心血管事件的安全隐患，本文主要评价阿奇霉素对斑马鱼心脏形态和功能的影响，为抗菌类药物心脏毒性的作用机理研究及临床安全用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药物与动物 阿奇霉素粉末购自石家庄欧意药业有限公司，野生型和心脏转基因斑马鱼由澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室繁殖。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼胚胎形态和心率的观察及评价 挑选发育良好的2 d大的斑马鱼胚胎于12孔板，每孔12条，药物处理分别为：正常对照组和给药组(0.03、0.1、0.3和1 mm)。为了抑制斑马鱼的黑色素而清楚的观察斑马鱼的心脏形态及其功能，将斑马鱼在含有1-苯基-2-硫脲(PTU)的培养液里给药处理3 d后，将斑马鱼放置于室温，适应环境温度15 min以上。在体式显微镜观察下观察并记录斑马鱼的心率。将不同处理组的斑马鱼置于玻璃片上，用1%的低熔点琼脂固定使之固定其呈侧卧状态(两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面)或正卧状态(腹部向下方，身体左右对称)，用活细胞工作站系统CELLR(Olympus，日本)连续拍照片(200张/14 s的速度)。

1.2.2 斑马鱼心搏量的计算 按照文献报道的方法[3 - 4]，采用心搏量(stroke volume)进一步评价斑马鱼心脏的功能。从视屏文件找到心室的舒张期和收缩期图片(见图1),测量心室的长轴(用a表示)和短轴(用b表示)，用椭球形的体积公式计算心室的体积：V=4/3π(a/2)(b/2)2；心搏量的计算：Stroke volume=V舒张期-V收缩期。

图1 斑马鱼幼鱼心室长轴和短轴长度的测量方法

2 结果

2.1 阿奇霉素对斑马鱼胚胎心脏形态及其心率的影响 为了评价阿奇霉素对斑马鱼胚胎心脏功能的影响，我们首先对斑马鱼胚胎心脏形态和心率参数做了观察。心搏量反应心室每收缩1次射出的血液量，是评价心脏功能的一个重要指标。0.3 mm阿奇霉素对2 d大的斑马鱼胚胎处理3 d后，心包囊水肿形成(见图2B)，心脏体积变大，心膜出血。由图2C的统计结果可知，与正常对照组相比，0.3 mm和1 mm阿奇霉素造模组的心率明显下降(P< 0.05)。

A:对照组；B:0.3 mm阿奇霉素处理3 d后的斑马鱼心脏部位形态，箭头表示心脏部位；C:不同浓度的阿奇霉素对斑马鱼心率的影响；与对照组比较，#P <0.05。图2 阿奇霉素对斑马鱼心脏形态和心率的影响

2.2 阿奇霉素对斑马鱼幼鱼心搏量的影响 为了进一步评价阿奇霉素对斑马鱼胚胎心脏功能的影响，我们对其心搏量做了计算统计。0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素对2 d大的斑马鱼胚胎处理3 d后，心脏的心搏量减少(见图3AB和CD)。由图3E的统计结果可知，与对照组相比，0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素处理组的心搏量明显下降(P<0.05)。

A:对照组心室舒张期，箭头表示斑马鱼的心室; C:对照组心室收缩期；B:0.3 mm阿奇霉素组斑马鱼心室舒张期;D:0.3 mm阿奇霉素组斑马鱼心室收缩期；E:阿奇霉素对斑马鱼胚胎心搏量的影响；与对照组比较，#P <0.05。图3 阿奇霉素对斑马鱼胚胎心脏功能的影响

3 讨论

斑马鱼在发育早期，身体是透明的，在显微镜下可以直观快速的观察评价心脏的功能，是研究心脏功能的理想体内模型。斑马鱼的胚胎在受精2 d后，心脏发育基本成形[5]。0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素作用受精2 d的斑马鱼胚胎3 d后，可见其心脏肿大、心膜出血、心率下降、心搏量减少等。本实验首次发现阿奇霉素对斑马鱼胚胎心脏有一定的毒性作用，与最近临床阿奇霉素心脏毒性的报道的结果相符，故可以用来研究阿奇霉素等抗菌药物引起的心脏毒性。

心血管疾病严重危害我国人口健康，近几年因心血管疾病死亡占总死亡原因的41%[6],某些严重心脏毒性已经成为人类死亡的原因之一。由于心脏毒性导致开发药物失败和从市场上撤回的事件也屡屡发生。比如抗菌药物格帕沙星(Grepafloxacin)于1993年在美国上市，于1999年由于心脏的毒副作用从市场撤出[7]，2007年的罗格列酮心血管安全性争议[8]。确保药物无心脏毒副作用，是药物开发的重要问题，越来越受到国内外相关研究部门的重视。近日，国外报道大环内酯类抗生素类阿奇霉素会引起心血管的毒性作用。由阿奇霉素引起的心血管等毒性所导致的死亡风险比阿莫西林高出很多。其中每21 000服用阿奇霉素的病人就有1人由于心血管的毒副作用引起死亡，其引起死亡的风险远远高于同等条件下的阿莫西林[9]。2013年5月在《新英格兰医学杂志》再次发表了关于阿奇霉素诱发心脏毒性的文章。我们回顾分析了从1997年到2010年使用阿奇霉素和未使用该类药物患者心脏性猝死事件。其中2组是服用和未服用阿奇霉素的样本量均为1 102 050例。另外2组分别为阿奇霉素和青霉素V给药，样本量分别为1 102 419和7 364 292。结果发现，与未使用阿奇霉素的病例相比，使用5 d疗程阿奇霉素相关的心血管死亡事件明显升高，发生率约1.1‰。与青霉素相比，心血管事件的发生没有明显增加[10]。其次，我国对此现象也做了简单的报告[11 - 12]。

阿奇霉素引起QT间期延长、诱发心动过速等心脏毒性的具体机制不清楚。大环内酯类抗生素包括红霉素(静脉滴注或口服)、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、螺旋霉素的心脏毒性的作用机制有一定的报道。实验证实，红霉素可使豚鼠心肌细胞动作电位显著延长，通过抑制钠钾离子通道，并特异性地抑制了跨膜钾电流[13 - 14]，这可能是红霉素在临床应用诱发心脏毒性的机制，特别是心律失常的机制。阿奇霉素心脏毒性的机制，可能也与心肌细胞动作电位和钾离子电流的调控有关系。虽然阿奇霉素抗菌作用广泛、抗菌活性强，但其心脏的毒副作用，会严重影响其在临床上使用。目前，还未见采用心脏保护药物以减轻抗菌药物引起的心脏毒性的报道。因此，阐明阿奇霉素心脏毒性的作用机理，寻找针对该药有效的心脏保护药物和对阿奇霉素化学结构的进一步改进修饰以达到减轻心脏毒性是一种可行的研究方向，值得医药工作者去思考研究。其次，由阿奇霉素诱导的斑马鱼胚胎心脏毒性模型成功的建立，为抗菌类药物心脏毒性的作用机理研究奠定了基础。

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