进境旅客携带的澳大利亚苹果中美澳型核果褐腐病菌的检测与鉴定

许萍萍 李彬 吴翠萍 漆少廷 罗朝科 罗建国 安榆林

摘要：南京禄口国际机场口岸从进境旅客携带的澳大利亚苹果中截获疑似褐腐病果。病果表面靠近果肩处有水渍状褐色病斑，经保湿培养后褐色病斑迅速扩展至全果，果实表面出现灰褐色绒状霉层，果实腐烂。对病果进行分离培养、形态学观察、PCR检测及ITS序列分析和致病性测定后，将病菌鉴定为美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）。这是江苏省首次从旅客携带的澳大利亚苹果中截获该检疫性有害生物。

关键词：苹果病害；真菌鉴定；旅检；美澳型核果褐腐病菌

中图分类号： S41-3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0119-03

收稿日期：2013-09-06

作者简介：许萍萍（1982—），女，江苏盐城人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫工作。E-mail：xupp@jsciq.gov.cn。褐腐病是桃、李、杏、苹果等果树上的一种危害严重的水果病害，引起该病害的病原菌之一的美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）是我国进境植物检疫性有害生物，该病原菌的主要寄主为蔷薇科果树，尤其以核果类李属（Prunus）的李、杏、桃、油桃、樱桃、苹果、梨和葡萄等果树受害最严重，曾对北美和澳大利亚的核果造成巨大损失。美澳型褐腐病菌既能在果园中引起危害，又能危害储藏期果实，并可在果实中潜伏侵染，随病果远距离传播，美澳型核果褐腐病菌目前在日本、印度、韩国、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、法国等多个国家均有分布，我国北京和台湾地区也有局部发生危害的报道[1]。该病菌可随带病的苗木及水果通过贸易和旅客携带进行远距离传播。2013年6月，南京禄口国际机场口岸从进境旅客携带的澳大利亚苹果中截获一批可疑病果。为防止美澳型核果褐腐病菌传入我国，笔者对病果及其分离物进行了分离培养、病原菌形态学观察、PCR分子检测，并遵循柯赫氏法则进行致病性测定，对这批病苹果携带的病菌进行了检测和鉴定。

1材料与方法

1.1材料与试剂

材料为南京禄口国际机场从进境旅客携带的澳大利亚苹果中截获的可疑病果。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

1.2症状检查及保湿培养

对可疑病果的症状进行观察，取有褐色病斑的果实直接进行分离培养。病果初期有褐色病斑，温度适宜时，褐色病斑迅速扩大至全果，果肉随之变软腐烂。潮湿条件下，病果表面凹陷处有灰色霉层，其上产生分生孢子梗束。有些潜伏侵染的果实表面暂时无明显症状，对这类果实可进行保湿培养，将果实放在密闭的塑料盒中，20～25 ℃下保湿培养，7 d 后开始每天检查，直至出现褐腐病斑症状，再对果实进行分离培养。

1.3组织分离与培养

取有褐色病斑的果实进行分离培养，用70%乙醇对果实表面进行消毒，等乙醇挥发后，从病健交界处切取或用镊子撕取边长为5～10 mm 的样品，放在PDA培养基上，25 ℃培养，待菌落出现镜检。

1.4形态学观察与生物学鉴定

如果菌落上的分离物形态特征与美澳型核果褐腐病菌相似，则对疑似菌株进行纯化，并对菌落的颜色、生长速度、产孢量和孢子堆的形状等菌落形态学特征和生物学性状进行观察和测定。先将转到PDA 上的美澳型核果褐腐病菌疑似菌株放在22 ℃下暗培养4 d，用4 mm的打孔器在菌落边缘打孔取样，将菌落转移至直径为9 cm的PDA 培养皿中央，22 ℃下12 h光照/12 h暗培养，光照波长为320～380 nm、18 W黑光灯（近紫外燈）2盏，置于培养皿上方约15 cm处，培养3 d后开始每天测量菌落直径，直到第5天开始计算并记录菌落的生长速度、颜色、产孢量、孢子堆形状。

1.5分子生物学鉴定

1.5.1DNA提取采用Tooley等的碱裂解法[2]直接从培养基中快速提取菌丝DNA。疑似菌株经纯化后在PDA上生长 2 d，取菌丝块放入2 mL的离心管中，加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直径为3 mm的钢珠，在球磨仪（Retsch MM400，德国）上以30 f/s的频率振荡180 s，12 000 r/min离心5 min，取10 μL上清液直接溶于90 μL 100 mmol/L Tris溶液（pH值8.0）中。也可以采用CTAB 方法或真菌基因组提取试剂盒（如DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN，德国）提取病菌DNA。DNA提取后直接进行PCR检测或-20 ℃保存备用。

1.5.2PCR引物根据文献[1]中推荐的方法，对分离到的疑似菌株采用PCR检测方法进行鉴定。美澳型核果褐腐病菌的特异性引物ITS1-Mfcl 和ITS4-Mfcl 序列为5′-TATGCTCGCCAGAGGATAATT-3′和5′-TGGGTTTTGGCAGA-AGCACACT- 3′，预期扩增的PCR产物大小为 356 bp，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司代为合成。

1.5.3PCR扩增50 μL PCR 反应体系中含有1×PCR缓冲液（无Mg2+）、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、各引物0.2 μmol/L、1.25 U Taq DNA聚合酶、2 μL DNA溶液，补ddH2O至反应总体积为50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，67.5 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.5.4PCR产物的检测PCR反应结束后，将PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测， 用凝胶成像仪观察、拍照、记录检测结果。

1.5.5PCR产物核苷酸序列分析PCR 产物纯化后委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行核苷酸序列测定。采用BioEdit和DNAStar软件对测序结果与GenBank发表的美澳型核果褐腐病菌ITS核苷酸序列进行比较和同源性分析。

1.6致病性测定

采用菌丝块接种法，用4 mm的打孔器在菌落边缘打孔取样，作为接种菌丝块。选用新鲜健康的苹果果实，先用70%乙醇对要接种的果实表面进行消毒，再用解剖刀切开接种部位切取少量果肉，将菌丝块接入果肉中，将接种的苹果放入密闭塑料盒中，22 ℃下保湿培养。同时设置空白对照。

2结果与分析

2.1病果症状

截获的病果初期有褐色病斑，经保湿培养后4 d，褐色病斑迅速扩大至全果，果实表面凹陷处密布灰褐色绒状霉层（图1），其上产生大量分生孢子梗束，果肉随之变软腐烂。

2.2病菌生物学特性

2.2.1菌落特征取病果病健交界处果皮进行组织分离，对疑似美澳型核果褐腐病菌菌落进行纯化，取直径4 mm菌丝块在PDA 上22 ℃光暗交替培养，菌落生长速度很快，7 d后菌落布满直径 9 cm 培养皿。菌落榛子色或灰褐色，边缘较整齐，产孢量丰富，菌落表面形成明显的同心轮纹状分生孢子堆（图2）。菌株的培养特性与van Leeuwen等描述的美澳型核

果褐腐病菌的菌落特征[3-4]一致。

2.2.2病菌形态经显微镜观察，疑似菌株菌丝无色，有分枝，分生孢子梗较短，顶端串生分生孢子，芽生，链状排列，柠檬形或卵圆形，近无色，单胞（图3）。分生孢子为 10.28～19.65 μm × 6.62 ～ 14.60 μm，平均值为14.70 μm × 9.79 μm。分生孢子萌发产生后产生的芽管较长。病菌的形态学特征与已报道的美澳型核果褐腐病菌的形态特征[1，3，5]完全相符。

2.3病菌PCR分子检测及序列分析

2.3.1病菌PCR检测采用美澳型核果褐腐病菌特异性引物ITS1-Mfc1和ITS4-Mfc1对疑似菌株进行PCR分子检测。结果表明，PCR擴增出1条大小为356 bp的特异性目的条带，与阳性对照大小一致（图4）。将PCR产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司纯化测序。

2.3.2病菌PCR 产物序列测定与同源性分析PCR 产物经测序和BLAST 分析，结果表明，PCR 产物核苷酸序列与 GenBank 中40多个美澳型核果褐腐病菌已知的ITS基因序列（GenBank登录号：JN176556、HQ846919、GU967379、GQ979713、FJ515894、AM887528、DQ314727等）同源性均为100%。序列比对的结果进一步验证了PCR 产物是美澳型核果褐腐病菌的特异性产物。

2.4致病性测定

采用菌丝块对新鲜健康的苹果果实进行接种，经保湿培养， 苹果果实3～4 d出现褐色病斑，病斑扩展迅速， 8 d后整

个果实表面全部变为褐色，12 d后果实表面被散生的灰裼色绒状霉层覆盖（图5），其上产生大量分生孢子堆，果实腐烂。空白对照无褐腐症状出现，也无绒状霉层产生。从接种发病的苹果果实上可重新分离到疑似美澳型核果褐腐病菌菌株，病菌的生物学特性与接种病菌完全相同。

3结论与讨论

美澳型核果褐腐病菌有3个近似种，即核果链核盘菌（M.laxa）、果生链核盘菌（M. fructigena）和 M.polystroma。这4个种可通过菌落特征、分生孢子大小、分生孢子萌发产生的芽管、产孢量和PCR特异性扩增来加以区分[1，3-6]，通过ITS序列及微卫星序列差异建立的常规PCR方法[1，5-7]、SYBR实

时PCR方法[8]和Taq Man-MGB探针[9]等PCR检测方法可以快速、准确地在种的水平上将这4个近似种区分开来。

美澳型核果褐腐病菌是我国进境植物检疫性有害生物，该病原菌主要危害核果类李属果树，会给果园造成巨大损失。除了苹果以外，我国口岸多次从旅客携带的李、樱桃、西梅及进境贸易水果（葡萄、李和樱桃）货物中截获过该病菌[5，10-12]。该病菌既能在果园中引起危害，又能危害储藏期果实，并可在果实中潜伏侵染，随病果远距离传播。进境旅客携带的水果虽然数量少，但是水果种类多，来源广，产地复杂，美澳型核果褐腐病菌随水果传入的疫情风险很高，所以我国各口岸应加强对入境旅客携带水果的检疫，防止通过旅客携带的水果将该病菌传入我国，以保护我国水果生产和贸易的安全。

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