利用玉米秸秆制备木霉菌可湿性粉剂

田连生 刘凤云 沙建

摘要：采用玉米秸秆粉固体发酵法制备木霉菌孢子粉，并利用正交试验筛选出最佳的固体培养基配比：100%秸秆粉+20%葡萄糖+0.5%（NH4）2SO4+0.02%KH2PO4+150%水。通过木霉菌T21与各助剂的生物相容性试验和正交试验，筛选出木霉菌可湿性粉剂配方：50%木霉孢子粉+2%MK20+2%拉开粉+46%高岭土。制成产品的各项指标均符合Q/BASW 02—2006《木霉菌可湿性粉剂质量标准》。

关键词：木霉菌；生物相容性；可湿性粉剂

中图分类号： S183；S482.2+92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0116-03

收稿日期：2013-09-03

基金项目：江苏省高等学校大学生实践创新项目（编号：2012JSSPITP4029）。

作者简介：田连生（1962—），男，河北保定人，教授，从事生物农药及生物降解方面的研究工作。Tel：（0514）85433018；E-mail：lianshengt@163.com。自1932年Weindling发现木霉菌对植物病原菌具有拮抗作用以来，各国科学家从多方面展开了对木霉菌的生防研究工作[1-4]。木霉菌（Trichoderma spp.）属半知菌类，具有广谱性、安全性和很强的适应性，通过营养竞争、重寄生、抗生性以及诱导植物的抗性作用机制[5-6]而对多种植物病原菌如腐霉属（Pythium）、镰孢属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）、丝核菌属（Rhizhotonia）、葡萄孢属（Botrytis）等有很强的抑制作用；同时木霉菌能防治多种植物病害，而不会对环境与人类健康造成影响。由于木霉菌具有适应性强、产孢量大、病原菌不易产生抗药性等优点，目前已被国内外广泛用于防治植物的真菌性病害。以色列Makhteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂（Trichodex），为 25%可湿性粉剂，可以用于防治灰霉病、苗枯病、霜霉病和白粉病等叶部病害及果实在储藏期的腐烂；在美国，利用哈茨木霉防治由腐霉菌引起的蔬菜根腐病也取得了很好的效果。本研究试图以玉米秸秆为原料，通过固体发酵制备木霉孢子粉，再配以适量的润湿剂、分散剂和载体等农药助剂来研制木霉可湿性粉剂。我国是农业大国，秸秆资源丰富，每年的秸秆产量5.7亿～60亿t，以废弃的农作物秸秆为原料既可以降低木霉菌剂的生产成本又可以减少农作物秸秆焚烧而造成的环境污染，从而为农作物秸秆的综合利用提供了一条新途径。

1材料与方法

1.1试验材料

拮抗性木霉菌（Trichoderma spp.）T21，由笔者所在单位从多地采集的土样中分离、纯化后经过与灰霉菌、立枯丝核菌等病原菌的对峙培养筛选得到。

分散剂：MK20、NNO、S50，安阳助剂厂；润湿剂：拉开粉、十二烷基苯磺酸钠、MF，邢台蓝天精细化工有限公司；载体：硅藻土、轻质碳酸钙、高岭土，安徽砀山助立特农用农药助剂厂。

1.2种子液培养

取100 mL种子液培养基放入250 mL三角瓶中，灭菌后接入拮抗性木霉菌T21，于25 ℃、180 r/min振荡培养48 h，作为种子液备用。

种子液培养基（1 L）：2%玉米粉，2%葡萄糖，0.1%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，补足水至1 000 mL，调节pH值为6。

1.3固体发酵培养基的筛选

以来源广泛、价格低廉易得的玉米秸秆粉作为固体培养基原料，设计以玉米秸秆粉、水、葡萄糖、无机盐为影响因子的4因素3水平正交试验，正交试验设计见表1。

按照上述正交试验设计，先称取10 g秸秆粉（过20目）于250 mL三角瓶中，然后将葡萄糖、无机盐融入水中，再将溶液放入三角瓶中与秸秆粉混合均匀，灭菌冷却后接入10%种子液，搅拌均匀后于25 ℃恒温培养6 d。分别取5 g各处理发酵物，于80 ℃干燥6 h后准确称取1.0 g放入100 mL带玻璃珠的三角瓶中，于200 r/min振荡30 min，用血球计数板测定固体发酵物中的木霉菌分生孢子数。每处理重复3次，按最佳固体发酵培养基的配比进行发酵，制备木霉菌孢子粉。

1.4助剂与木霉菌相容性的测定

由于木霉菌分生孢子为生物活体，因此在筛选各农药助剂时，除了要考虑各助剂对可湿性粉剂的理化性能外，还应该考虑筛选助剂与分生孢子的生物相容性以及是否对分生孢子的萌发产生影响[7]。

1.4.1菌落生长的测定将PDA培养基加热融化并放至 40～45 ℃ 时，分别加入一定量的载体、分散剂和润湿剂，使总浓度达到100 mg/L，然后将培养基倒入培养皿，制成药物培养基。用打孔器截取直径为45 mm的T21木霉菌菌块并接入上述药物培养基的中央，于25 ℃恒温培养46 h，用“十”字交叉法测量菌落直径并记录。每处理重复3次。并以不加助剂的PDA培养基作为空白对照。

1.4.2孢子萌发测定取适量木霉菌孢子粉，用无菌水配成1.5×103 CFU/L的分生孢子悬浮液，取0.1 mL均匀涂布在上述各药物培养基表面，于25 ℃恒温培养50 h，观察分生孢子萌发形成的菌落数，每处理重复3次；用空白PDA培养基作空白对照。

1.5助剂的配比筛选

木霉菌可湿性粉剂的配制是以木霉菌孢子粉为基础，再加入适量的分散剂、润湿剂和载体复配而成的[8-9]。其中分散剂和润湿剂是2个最主要的助剂，它们的种类和加入量對可湿性粉剂的理化性能、防治效果和稳定性有很大影响。各因素水平的正交设计见表2。

比例（%）B：2%分散剂C：2%润湿剂D：46%载体130MK20MF硅藻土240NNO十二烷基磺酸钠 高岭土350S50拉开粉轻质钙

通过测定正交试验中各处理的润湿时间和悬浮率，筛选出最佳可湿性粉剂所用助剂类型和配方。其中润湿时间按照GB/T 5451—2001《农药可湿性粉剂润湿性测定方法》进行测定，悬浮率按照GB/T 14825—2006《农药悬浮率测定方法》进行测定。

1.6木霉菌可湿性粉剂的配制

根据正交试验结果筛选出的最佳配方，分别按比例称取木霉菌孢子粉、分散剂、润湿剂、载体，充分混和后用高速气流粉碎机粉碎成325目大小，再用混合器混匀，按Q/BASW02—2006《木霉可湿性粉剂质量标准》进行产品抽样检测，合格后包装为成品。

2结果与分析

2.1固体发酵培养基的筛选

以价格低廉易得的玉米秸秆粉为固体培养基的主要原料，设计了以玉米秸秆粉、葡萄糖、水、无机盐为影响因子的4因素3水平正交试验，测定产孢量。正交试验结果见表3。

可以看出：各因子对固体发酵物的产孢量影响效果依次为：A>B>D>C。即：秸秆粉含量>含水量>葡萄糖含量>（NH4）2SO4+KH2PO4含量。产孢量最大的组合是A3B2C3D1，此组合不在试验设计中，但与之部分相同的A3B2C1D3组合的产孢量最高，为为12.90×109个/g，可认为最佳固体培养基（重量比50%）为：100%秸秆粉，20%葡萄糖，0.5%（NH4）2SO4+0.02%KH2PO4，150%水。

2.2菌落生长的测定

在25 ℃恒温培养箱中培养46 h后用“十”字交叉法测量各处理木霉菌落直径平均值，见图1。可以看出，木霉菌T21的生长基本不受拉开粉、MK20和高岭土的影响，其中拉开粉反而会对木霉菌的生长有一定的促进作用；S50、MF对木霉菌等的生长有一定的抑制作用。研究结果为润湿剂和分散剂的筛选提供了参考。

2.3孢子萌发的测定

的试验结果表明：高岭土、MK20的孢子萌发数与空白对照相比基本无差异，拉开粉对木霉菌T21有一定的促进作用；S50、MF的孢子萌发数明显低于对照处理。本结果与菌落生长结果一致，表明高岭土可以作为木霉菌可湿性粉剂的载体，拉开粉可以作为润湿剂，MK20可以作为分散剂。

2.4助剂的配比筛选

以正交试验各处理测定的润湿时间和悬浮率为标准，对各配方进行测定和评价，测定结果见表4。由表4中的极差R（悬浮率）数据可见：影响悬浮率的因素为A>D>C>B，即对悬浮率影响的次序分别为：孢子粉、载体、润湿剂、分散剂。悬浮率最佳的配比为A2B2C1D2，即40%孢子粉、2% NNO、2%MF、46%高岭土，但表中无此组合；A2B3C1D2组合的悬浮率可达到60%，但其中的S50对木霉菌生长有抑制作用；此外，A3B1C3D2组合的悬浮率可达586%，与60%差距不大。

极差R（湿润时间）的数据可见：影响润湿时间的因素大小分别为A>D>B>C，即对润湿时间影响的次序分别为：孢子粉、载体、分散剂、湿润剂。润湿时间的最佳配比为：A1B3C2D3，即30%孢子粉、2%S50、2%十二烷基磺酸钠、46%

各处理的正交试验结果L9（34）

处理号因素ABCD悬浮率

（%）润湿时间

（s）1111146.5168.52122247.9150.73133339.7200.14212350.3133.15223156.898.26231260.095.47313258.690.08321353.6120.99332151.7131.6K1（悬浮率）134.1155.4160.1155.0K2（悬浮率）167.1158.3149.9166.5K3（悬浮率）163.9151.4155.1143.6R（悬浮率）33.06.910.222.9K1（湿润时间）519.3391.6384.8398.3K2（湿润时间）326.7369.8415.4336.1K3（湿润时间）342.5427.1388.3454.1R（湿润时间）192.657.330.6118.0

轻质钙，但表中无此组合；A3B1C3D2组合条件的润湿时间可达90 s，因此木霉可湿性粉剂的最佳配方选择A3B1C3D2，即50%木霉孢子粉、2%MK20、2%拉开粉、46%高岭土。

2.5木霉菌可湿性粉剂的质量检测

采用Q/BASW 02—2006《木霉菌可湿性粉剂质量标准》对产品进行抽样检测，表5结果表明各项指标均符合标准。表5木霉菌可湿性粉剂的检测结果

类别木霉活孢子数

（个/g）悬浮率

（%）水分

（%）pH值细度（通过44 μm

试验筛）（%）润湿时间

（s）加速贮存试验[（54+2） ℃，14 d]

失活率（%）标准≥2.0×108≥80.05±16.0～7.0≥95≤120≤20.0测量数2.6×10880.156.29611519.8

3结论

经正交试验筛选出了最佳固体培养基：100%秸秆粉，20%葡萄糖，0.5%（NH4）2SO4，0.02%KH2PO4，150%水。

生物相容性试验表明：高岭土可作为木霉菌可湿性粉剂的载体，拉开粉可作为润湿剂，MK20可作为分散剂，而S50、MF对木霉T21的生长有一定的抑制作用。

助剂配比正交试验筛选出最佳的木霉可湿性粉剂配方为：50%木霉孢子粉、2%MK20、2%拉开粉、46%高岭土。

综合试验结果，本试验配制的木霉菌可湿性粉剂各项指标均符合Q/BASW02—2006《木霉菌可湿性粉剂质量标准》。

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