协助寄主缓解干旱胁迫的植物根围细菌的分离及活性初探

杨威+闫海霞+李师默+等

摘要：根据菌株离体条件下产酶活性，从分离到的183株植物根围细菌中筛选了5株具有显著IAA（吲哚乙酸）和ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶活性的菌株进行温室试验，评价其协助寄主植物缓解干旱胁迫压力的能力。其中菌株H4-1L相对于对照组能够显著缓解干旱对于植物的胁迫压力，根长增加25%～31%，鲜重增加27%～44%，叶绿素含量增加21%～83%，根系活力增加50%～56%。通过形态学特征及16S rDNA序列比对，鉴定该菌株为Pseudomonas putida。

关键词：植物根围细菌；抗旱；IAA；ACC脱氨酶；恶臭假单胞

中图分类号： S423+.4；Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0349-03

收稿日期：2013-09-06

基金项目：江苏省淮安市科技项目（编号：HASZ2012023）。

作者简介：杨威（1983—），男，河北承德人，博士，讲师，主要从事植物病害生物防治研究。E-mail：yangw107@126.com。

通信作者：罗玉明，教授，主要从事作物高效生产技术研究。E-mail：yumingluo@163.com。当植物蒸腾速率超过水分吸收速率或土壤缺乏植物可利用的水分时，植物发生干旱胁迫。干旱胁迫是田间条件下存在最广泛的一种作物生长逆境。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的1/3[1]，我国干旱、半干旱地区约占国土面积的1/2，同时其他半湿润甚至湿润地区也常会有周期性、季节性或临时性的干旱[2]。2011年我国长江中下游五省大旱，据报道约造成农作物受灾面积370.51万hm2，其中绝收面积16.68万hm2，直接经济损失149.4亿元。

目前，在干旱条件下，除了力所能及的调度灌溉水以外，人们主要依靠以下几种途径来缓解干旱对农业生产造成的危害：（1）化学调控方法。一些能促进水分调节、渗透调节、气孔调节和光合调节等一系列生理生化机制的化学物质能增强植物的代谢活性，提高其抗旱性[3-4]，但是无论哪一种化学调节剂都存在经济成本问题以及对于环境、土壤的副作用；（2）基因工程。近年来利用基因工程技术改进植物体内干旱应答基因产物水平已成为培育抗逆性新品种的一种手段，至今已有不少植物已成功导入相关抗旱基因且抗旱程度也有所提高，如水稻、烟草、棉花等[5-6]。但是，利用基因工程培育抗旱品种在蔬菜方面的研究较少，另外在长期的进化过程中，植物自身也建立起了在面对干旱胁迫时的应答反应，并且植物自身调节抗旱能力有限，不足以应对持续干旱带来的胁迫压力。

自20世纪70年代植物根围促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）这个概念提出以来[7]，已经在不同寄主植物上、不同的生态环境中分离得到多种促生菌。这些微生物在促进植物生长、抑制病害发生、调节根围微生态结构各个方面得到了广泛的应用[8]，也为人类挽回了巨大的经济损失，其中一些品种已经进行商业化生产。近几年，有越来越多的学者开始不只是关注 PGPR 促生抗病方面的能力，而是将注意力转移到这些有益微生物在协助植物抗逆的作用上来，包括耐盐胁迫、耐干旱胁迫等[9]。Glick等报道，具有ACC（1-氨基环丙烷-1羧酸）脱氨酶活性的菌株能够降低植物根部乙烯含量，促进植物根部伸长[10]。Barea等也证明根部接种产IAA（吲哚乙酸）的菌株能够显著增加植物的干重和根长[11]。

本研究旨在通过离体条件下产酶活性筛选，选择具有IAA和ACC脱氨酶活性的植物根围细菌，并且在温室条件下评价其协助寄主植物缓解干旱胁迫的能力。

1材料与方法

1.1土壤采集及菌株分离

在江苏省淮安市武墩镇蔬菜大棚采集黄瓜与辣椒根围土壤样品。采集方法如下：每个温室5点取样，每点之间间隔大于10 m，另外取同一温室内非种植土壤1份作为对照。首先用铁锹挖开植物根基部深10 cm的土壤，然后用小刷子收集附着在植物根表层的土壤，收集后装入小号自封袋，标记编号迅速带回实验室进行下一步处理。

本研究采用LB和KB 2种培养基利用稀释涂平板法进行菌株的分离：每份土壤样品取1 g分别溶于9 mL无菌水，然后每组稀释到10-3、10-4、10-5。用移液器分别吸取 100 mL 到相应培养基上，涂布，每个梯度3次重复。标记后置于28 ℃温室培养箱培养，待菌落长出后，根据形态特征挑取进行纯化，-70 ℃保存备用。

1.2菌株代谢产物活性检测

IAA活性检测：将分离纯化后的细菌接种于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min条件下摇床培养1 d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50 μL Salkowski比色液（50 mL φ=35%的HClO4 +1 mL 0.5 mol/L FeCl3），将加入50 μL IAA（50 mg/L）的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30 min后观察，颜色变红者表示能够产IAA[12]。

ACC脱氨酶活性检测：将菌种接种到DFa培养液（KH2PO4 4 g/L、Na2HPO4 6 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，葡萄糖2 g，葡萄糖酸2 g，柠檬酸2 g，ACC终浓度为3 mmol/L，pH值7.2）于30 ℃、180 r/min条件下摇床培养1 d。以不接菌株的培养液做对照，检测培养液在600 nm下的吸光值，根据吸光值判断菌株是否能够在以ACC为唯一氮源的培养液中生长。

1.3温室试验

温室试验中所选用的黄瓜、辣椒品种分别为新津优1号、大禹牛角王，所用基质购自淮安市柴米河农业科技有限公司。首先用穴盘育苗，待苗长出3～4片真叶后移栽到盆钵中，温室条件为30 ℃，光照时间16 h，黑暗时间8 h。

根据菌株产酶活性筛选结果选择5株菌株进行温室试验。每批温室试验分别设5个处理组和2个对照组，每个处理组3次重复，每个重复24株植株。对照组1不接种菌株，每隔3 d浇水20 mL/盆，对照组2不接种菌株，移栽1周内正常浇水2次，1周后开始进行干旱处理。5个处理组处理方式如下：移栽时用109 CFU/mL 的菌悬液灌根处理，20 mL/盆，移栽1周内正常浇水2次，1周后开始进行干旱处理。

1.4植株生理指标检测

温室试验植株移栽后第21天分别检测各处理组根长、鲜重、叶绿素含量、根系活力以及叶片相对电导势。检测方法参照《植物生理学试验指导》。

1.5菌株鉴定

菌株基因组DNA提取采用树脂型基因组试剂盒（上海赛百盛基因技术有限公司），以提取的基因组DNA为模板，利用16S通用引物扩增其16S rDNA片段并测序（南京金斯瑞生物科技有限公司）。结果提交NCBI数据库比对。

2结果与分析

2.1菌株分离结果

如图1所示，本试验所采集的土壤样品中，黄瓜根围细菌数量明显多于辣椒，10-3稀释液在LB培养基上得到的菌落数最多为231，而辣椒根围土壤中分离到的最多菌落数为24。从采集位点来看，不同位点之间根围细菌的数量差别较大，另外根围土壤中细菌数量明显多于非根围土壤。

2.2菌株代谢产物活性检测结果

本研究将分离得到的182株根围细菌分别检测其产IAA和ACC脱氨酶活性，其中产IAA的菌株48株，具有ACC脱氨酶活性的菌株37株，二者兼具的菌株13株。选择其中5株菌株进行温室试验（表1），评价其协助寄主植物缓解干旱胁迫的能力。

2.3温室试验结果

本研究中将筛选出来的5株菌株分别进行了2批次温室试验，所用植株分别为黄瓜和辣椒。从表2可以看出，与对照组2相比，菌液处理组能够在干旱处理条件下增加黄瓜植株的根长、鲜重、叶绿素含量以及根系活力。其中菌株H4-1L、

温室试验菌株信息

菌株编号来源产IAA

活性吸光值

（ACC培养液）*H2-10K黄瓜根围土，KB培养基+1.74HCK-17L黄瓜非根围土，LB培养基+1.67H4-1L黄瓜根围土，LB培养基+1.83L4-8L辣椒根围土，LB培养基+1.52L5-10L辣椒根围土，LB培养基+1.62注：“+”代表参试菌株培养后与对照相比产生明显红色；“*”菌株接种到ACC作为唯一氮源的培养液中培养24 h后以未接种的培养液为对照检测吸光值，表中数值为3次重复试验的平均值。表2第1批次温室试验结果（黄瓜）

电导率L4-8L14.5±2.6a4.84.69±0.55b42.631.22±0.56c19.01.78±0.03c38.014.33±3.82aH4-1L17.33±2.52a25.34.75±0.19b44.431.67±0.28bc20.71.93±0.03b49.64.16±0.48bL5-10L14±1.73a1.23.78±0.52b14.932.66±1.1ab24.51.43±0.03e10.914.16±1.75aH2-10K14.67±0.76a6.13.3±0.55b0.329.71±0.39d13.21.28±0.06f-0.813.51±0.3aHCK-17L15.33±0.76a10.84.03±0.58b22.531.97±0.79bc21.82.42±0.07a87.614.87±4.7aCK213.83±4.37a3.29±1.36b26.24±0.38e1.29±0.06f13.25±1.79aCK114.17±1.26a2.56.91±2.08a110.033.3±0.16a26.91.56±0.08d20.912.23±0.91a注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

HCK-17L增加效果比较明显，特别是对根长和根系活力2项指标，菌株H4-1L、HCK-17L处理组高于正常浇水的对照组1。从相对电导率来看，菌株H4-1L处理组明显降低植株叶片的相对电导率，而其他处理组之间没有明显差异。

与黄瓜相比，各个处理组在辣椒植株上也体现相似的趋势，其中H4-1L和HCK-17L能够明显增加辣椒植株的根长、鲜重、叶绿素含量以及根系活力，特别是对于根长和根系活力2个指标，H4-1L和HCK-17L处理组的促进效果高于正常浇水的对照组1。另外H4-1L还能够显著降低辣椒叶片的相对电导率（表3）。

从两批次温室试验结果综合来看，菌株H4-1L协助寄主植物缓解干旱胁迫的效果更稳定。表3第2批次温室试验结果（辣椒）

处理根长

电导率L4-8L10.47±3.52a-5.10.8±0.18b25.022.37±0.57d21.71.61±0.03c28.844.23±7.38aH4-1L14.43±6.84a30.80.81±0.17b26.633.61±0.32a82.91.95±0b56.038.42±5.73aL5-10L11.13±0.85a0.90.72±0.16b12.521.52±0.05e17.11.4±0.01de12.044.39±7.85aH2-10K9.93±2.39a-10.00.73±0.12b14.119.91±0.15f8.31.3±0.18e4.045.12±6.69aHCK-17L11.83±4.74a7.30.86±0.13b34.424.12±0.26c31.23.27±0.01a161.642.57±2.1aCK211.03±3.8a0.64±0.02b18.38±0.33g1.25±0.05e48.57±4.42aCK111.47±0.87a4.01.88±0.69a193.826.51±0.18b44.21.51±0.2cd20.843.77±2.54a注同表2。

2.4菌株鉴定结果

通过16S rDNA序列比对，5株菌株鉴定结果如表4所示，其中H4-1L与恶臭假单胞菌株（GenBank登录号CQ303714.1）序列相似性100%。另外菌株H4-1L革兰氏染色反应阴性，在LB培养基上可形成1～3 mm菌落，呈圆形、边缘不整齐，白色，表面光滑。与《常用细菌学鉴定手册》中假单胞菌Pseudomonas的特性一致。故鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。

株测序比对结果

编号鉴定结果相似性

（%）L4-8LArthrobacter sp.（EF612294.1）99H4-1LPseudomonas putida（CQ303714.1）100L5-10LBacillus amyloliquefaciens（KF160918.1）99H2-10KAgrobacterium sp.（GU726172.1）100HCK-17LBacillus cereus（KF234451.1）100

3讨论

植物根围细菌作为植物根围土壤中的一个特殊类群，号称植物的“第二基因组”，与植物的健康生长息息相关[13]。除了防病促生相关特性研究，近年来许多学者开始关注植物根围细菌在协助寄主植物抗逆中的作用，包括抗干旱、抗重金属污染等。Jacobson等报道具有ACC脱氨酶活性的恶臭假单胞菌株能够水解乙烯合成前体ACC，阻止乙烯合成从而促进根的伸长，并且讨论了相关酶学性质[14-15]。

本研究通过离体条件下菌株产IAA和ACC脱氨酶活性筛选出5株植物根围细菌并且在温室条件下评价其协助寄主植物缓解干旱胁迫能力。其中菌株H4-1L同时具有IAA和ACC脱氨酶活性，在温室试验中，该菌株能够在干旱条件下促进黄瓜和辣椒根部伸长、增加植物鲜重、提高叶绿素含量以及根系活力，与对照组相比，能够协助寄主缓解干旱带来的胁迫压力，提高植株对于干旱的耐受性。在环境不断恶化的大背景下，具有一定的开发潜力。但是对于菌株的接种方式、多菌合剂的组合以及不同剂型的尝试等本研究并未涉及，这些条件对于成功开发一种成熟的菌剂至关重要，也是本研究今后需要进一步探索的内容。

参考文献：

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[2]夏爱，邓西平，薛菘. 植物抗旱的分子生物学机制研究进展[J]. 乐山师范学院学报，2001，16（4）：65-69.

[3]Zeid I M，Shedeed Z A. Alterations in Nitrogen metabolites after putrescine treatment in alfalfa under drought stress[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2007，10（9）：1513-1518.

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[5]Zhang Lei，Xiao Shanshan，Li Wenqi，et al. Overexpression of a harpin-encoding gene hrf1 in rice enhances drought tolerance[J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（12）：4229-4238.

[6]韩立敏，俞嘉宁，巨文峰. 转TaLEA1基因丹参植株的耐盐与耐旱性[J]. 植物生理与分子生物学学报，2007，33（2）：109-114.

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[15]Hontzeas N，Zoidakis J，Glick B R，et al. Expression and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from the rhizobacterium Pseudomonas putida UW4：a key enzyme in bacterial plant growth promotion[J]. Biochimica et Biophysica acta，2004，1703（1）：

2.4菌株鉴定结果

通过16S rDNA序列比对，5株菌株鉴定结果如表4所示，其中H4-1L与恶臭假单胞菌株（GenBank登录号CQ303714.1）序列相似性100%。另外菌株H4-1L革兰氏染色反应阴性，在LB培养基上可形成1～3 mm菌落，呈圆形、边缘不整齐，白色，表面光滑。与《常用细菌学鉴定手册》中假单胞菌Pseudomonas的特性一致。故鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。

株测序比对结果

编号鉴定结果相似性

（%）L4-8LArthrobacter sp.（EF612294.1）99H4-1LPseudomonas putida（CQ303714.1）100L5-10LBacillus amyloliquefaciens（KF160918.1）99H2-10KAgrobacterium sp.（GU726172.1）100HCK-17LBacillus cereus（KF234451.1）100

3讨论

植物根围细菌作为植物根围土壤中的一个特殊类群，号称植物的“第二基因组”，与植物的健康生长息息相关[13]。除了防病促生相关特性研究，近年来许多学者开始关注植物根围细菌在协助寄主植物抗逆中的作用，包括抗干旱、抗重金属污染等。Jacobson等报道具有ACC脱氨酶活性的恶臭假单胞菌株能够水解乙烯合成前体ACC，阻止乙烯合成从而促进根的伸长，并且讨论了相关酶学性质[14-15]。

本研究通过离体条件下菌株产IAA和ACC脱氨酶活性筛选出5株植物根围细菌并且在温室条件下评价其协助寄主植物缓解干旱胁迫能力。其中菌株H4-1L同时具有IAA和ACC脱氨酶活性，在温室试验中，该菌株能够在干旱条件下促进黄瓜和辣椒根部伸长、增加植物鲜重、提高叶绿素含量以及根系活力，与对照组相比，能够协助寄主缓解干旱带来的胁迫压力，提高植株对于干旱的耐受性。在环境不断恶化的大背景下，具有一定的开发潜力。但是对于菌株的接种方式、多菌合剂的组合以及不同剂型的尝试等本研究并未涉及，这些条件对于成功开发一种成熟的菌剂至关重要，也是本研究今后需要进一步探索的内容。

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[11]Barea J M，Brown M E. Effects on plant growth produced by Azotobacter paspali related to synthesis of plant growth regulating substances[J]. Journal of Applied Bacteriology，1974，37（4）：583-593.

[12]Libbert E，Risch H. Interactions between plants and epiphytic bacteria regarding their auxin metabolism：V.Isolation and identification of the IAA-producing and destroying bacteria from pea plants[J]. Physiologia Plantarum，1969，22（1）：51-58.

[13]Berendsen R L. Pieterse CMJ and bakker PAHM.the rhizosphere microbiome and plant health[J]. Trends in Plant Science，2012，17（8）：478-486.

[14]Jacobson C B，Pastemak J J，Glick B R. Partial purification and characterization of the enzyme ACC deaminase from the plant growth-pormoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2[J]. Canadian Journal of Chemistry，1994，40（2）：l019-1025.

[15]Hontzeas N，Zoidakis J，Glick B R，et al. Expression and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from the rhizobacterium Pseudomonas putida UW4：a key enzyme in bacterial plant growth promotion[J]. Biochimica et Biophysica acta，2004，1703（1）：

2.4菌株鉴定结果

通过16S rDNA序列比对，5株菌株鉴定结果如表4所示，其中H4-1L与恶臭假单胞菌株（GenBank登录号CQ303714.1）序列相似性100%。另外菌株H4-1L革兰氏染色反应阴性，在LB培养基上可形成1～3 mm菌落，呈圆形、边缘不整齐，白色，表面光滑。与《常用细菌学鉴定手册》中假单胞菌Pseudomonas的特性一致。故鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。

株测序比对结果

编号鉴定结果相似性

（%）L4-8LArthrobacter sp.（EF612294.1）99H4-1LPseudomonas putida（CQ303714.1）100L5-10LBacillus amyloliquefaciens（KF160918.1）99H2-10KAgrobacterium sp.（GU726172.1）100HCK-17LBacillus cereus（KF234451.1）100

3讨论

植物根围细菌作为植物根围土壤中的一个特殊类群，号称植物的“第二基因组”，与植物的健康生长息息相关[13]。除了防病促生相关特性研究，近年来许多学者开始关注植物根围细菌在协助寄主植物抗逆中的作用，包括抗干旱、抗重金属污染等。Jacobson等报道具有ACC脱氨酶活性的恶臭假单胞菌株能够水解乙烯合成前体ACC，阻止乙烯合成从而促进根的伸长，并且讨论了相关酶学性质[14-15]。

本研究通过离体条件下菌株产IAA和ACC脱氨酶活性筛选出5株植物根围细菌并且在温室条件下评价其协助寄主植物缓解干旱胁迫能力。其中菌株H4-1L同时具有IAA和ACC脱氨酶活性，在温室试验中，该菌株能够在干旱条件下促进黄瓜和辣椒根部伸长、增加植物鲜重、提高叶绿素含量以及根系活力，与对照组相比，能够协助寄主缓解干旱带来的胁迫压力，提高植株对于干旱的耐受性。在环境不断恶化的大背景下，具有一定的开发潜力。但是对于菌株的接种方式、多菌合剂的组合以及不同剂型的尝试等本研究并未涉及，这些条件对于成功开发一种成熟的菌剂至关重要，也是本研究今后需要进一步探索的内容。

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