响应面优化酶法提取灵芝多糖工艺条件

吕兴萍+杨薇红+马春娇

摘要：根据单因素试验结果，选用提取时间、提取温度、酶量3个反应因素作为研究对象，以多糖提取率为考察指标，通过响应面分析方法优化灵芝多糖的提取工艺条件。结果表明，最佳提取条件为提取温度51 ℃、酶量180%、提取时间2.5 h。在最佳工艺条件下，多糖提取率可达11.25%。

关键词：灵芝多糖；酶法提取；响应面分析

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金项目：江苏农林职业技术学院科技项目（编号：2010c09）。

作者简介：吕兴萍（1981—），女，江苏海安人，硕士，讲师，主要从事中药新剂型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，具有扶正固本等功效。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，具有免疫调节、抗辐射、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等广泛的药理活性[1-5]，因此灵芝多糖是目前灵芝研究的热点之一。目前灵芝多糖的提取方法主要是传统的水提醇沉法，此外还有膜分离法、酶解法、超声法、微波法等。其中，酶解法通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程，较大幅度提高多糖得率，不易破坏多糖的立体结构和生物活性[6]。响应面法以最经济的方式、较少的试验次数和较短的时间对所选的试验参数进行全面研究[7]。本试验拟采取酶解法提取灵芝多糖，以灵芝多糖提取率响应值为研究对象，应用响应面法对灵芝多糖的提取条件进行优化，以期得到灵芝多糖最佳提取工艺参数。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

HY-02型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司），上海菁华754分光光度计，电子天平，HH-S型恒温水浴锅（江苏金坛市金城国盛实验仪器厂），SHZ-IIIB循环式多用真空泵（浙江省临海市谭氏真空设备有限公司）。

灵芝子实体（江苏农林职业技术学院食用菌研究所）；纤维素酶（活性≥400 U/mg）；浓硫酸、苯酚、无水葡萄糖、乙醇均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1灵芝多糖的提取将干燥的灵芝切片在高速粉碎机下粉碎至一定粒度，精确称取0.25 g灵芝粉及适量的纤维素酶，加入纯化水在一定温度水浴下酶解提取后，在沸水浴中灭酶4 min，抽滤得灵芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的测定以葡萄糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，并采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，最后根据下式计算灵芝多糖提取率。

多糖提取率=（总糖量-还原糖量）/供试样品量×100%。

1.2.3响应面试验设计综合单因素影响多糖提取率的试验结果，选择提取温度、酶量、提取时间3个因素，以灵芝多糖的提取率为响应值，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，采用响应面法在3因素3水平上对灵芝多糖的提取条件进行优化。

2结果与分析

在单因素试验基础上，表2中试验1～12 为析因试验，13～17 为中心试验，17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在x1、x2、x3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。对所得数据进行回归分析，分析结果见表3。各因素经回归拟合后，

响应面试验回归模型分析结果

变异源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型项1.8170.26失拟度1.3130.443.480.129 7纯误差0.5040.13总变异20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

得回归方程为：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明该响应面回归模型达到极显著水平；失拟度P=0.129 7>0.05，说明检验结果与模型计算结果没有显著差异。提取温度、酶量、提取时间这3个因素的P值分别为0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，说明这3个因素均对灵芝多糖提取率有显著影响。对各个因素之间的交互作用进行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，说明各个因素之间的交互影响较小。回归方程的相关系数r=0.954 0，说明响应值（提取率）的变化有9540%来源于所选变量（即提取温度、提取时间和酶量）。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

为进一步直观说明提取温度、酶量和提取时间之间的交

互作用及其对多糖提取率的影响，用Design-expert软件对试验数据进行分析，得出响应面和等高线图，通过考察拟合响应面的形状，分析提取温度、酶量、提取时间对灵芝多糖提取率的影响。

多糖提取率在设定范围内随提取

时间延长而增大；而在设定的范围内，多糖提取率随酶量和提取温度增加均是上升后达到一个平衡，即最大值。从经济角度和提取的可行性考虑，将2.5 h定为最适提取时间，最佳提取酶量和提取温度可以由上述方程求导得到，即灵芝多糖提取最佳工艺条件为提取温度50.59 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，在该条件下由响应面模型预测的灵芝多糖提取率的理论值为11.55%。

为了验证试验的可靠性，采用最优提取条件浸提灵芝多糖，考虑到试验操作的可行性，为方便实际操作，将条件修正为提取温度51 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，在此条件下实际提取率11.25%，实际测定值比理论预测值（11.55%）低260%。由此可见，采用响应面分析法优化得到的浸提条件参数准确可靠，具有很好的实际应用价值。

3结论

在单因素试验设计的基础上，通过设计3因素3水平响应面分析法试验，确定灵芝多糖的提取最佳工艺参数为提取温度51 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，按照此工艺提取灵芝多糖的提取率较高，实际提取率可达11.25%。

参考文献：

[1]张志军，李淑芳，魏雪生，等. 灵芝多糖体外抗氧化活性的研究[J]. 化学与生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黄智璇，欧阳蒲月.灵芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李丽，雷林生，余传林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干扰素 γ含量的变化及免疫调节药物的干预作用[J]. 南方医科大学学报，2008，28（1）：65-68.

[4]李建军，雷林生，余传林，等. 灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫学相关性研究[J]. 中药材，2007，30（1）：71-73.

[5]吴锋，孟国梁，杨丽云，等. 灵芝多糖预防大鼠动脉粥样硬化的实验研究[J]. 南通大学学报：医学版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陈锦屏. 油枣多糖的酶法提取及其对多糖分子量分布的影响[J]. 食品科学，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艳，张小杰，王涛，等. 响应面法优化香椿叶多糖的提取条件[J]. 食品科学，2010，31（4）：106-110.任冰如，陈剑，吕寒，等. 红凤菜总黄酮的富集方法[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：260-262.endprint

摘要：根据单因素试验结果，选用提取时间、提取温度、酶量3个反应因素作为研究对象，以多糖提取率为考察指标，通过响应面分析方法优化灵芝多糖的提取工艺条件。结果表明，最佳提取条件为提取温度51 ℃、酶量180%、提取时间2.5 h。在最佳工艺条件下，多糖提取率可达11.25%。

关键词：灵芝多糖；酶法提取；响应面分析

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金项目：江苏农林职业技术学院科技项目（编号：2010c09）。

作者简介：吕兴萍（1981—），女，江苏海安人，硕士，讲师，主要从事中药新剂型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，具有扶正固本等功效。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，具有免疫调节、抗辐射、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等广泛的药理活性[1-5]，因此灵芝多糖是目前灵芝研究的热点之一。目前灵芝多糖的提取方法主要是传统的水提醇沉法，此外还有膜分离法、酶解法、超声法、微波法等。其中，酶解法通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程，较大幅度提高多糖得率，不易破坏多糖的立体结构和生物活性[6]。响应面法以最经济的方式、较少的试验次数和较短的时间对所选的试验参数进行全面研究[7]。本试验拟采取酶解法提取灵芝多糖，以灵芝多糖提取率响应值为研究对象，应用响应面法对灵芝多糖的提取条件进行优化，以期得到灵芝多糖最佳提取工艺参数。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

HY-02型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司），上海菁华754分光光度计，电子天平，HH-S型恒温水浴锅（江苏金坛市金城国盛实验仪器厂），SHZ-IIIB循环式多用真空泵（浙江省临海市谭氏真空设备有限公司）。

灵芝子实体（江苏农林职业技术学院食用菌研究所）；纤维素酶（活性≥400 U/mg）；浓硫酸、苯酚、无水葡萄糖、乙醇均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1灵芝多糖的提取将干燥的灵芝切片在高速粉碎机下粉碎至一定粒度，精确称取0.25 g灵芝粉及适量的纤维素酶，加入纯化水在一定温度水浴下酶解提取后，在沸水浴中灭酶4 min，抽滤得灵芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的测定以葡萄糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，并采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，最后根据下式计算灵芝多糖提取率。

多糖提取率=（总糖量-还原糖量）/供试样品量×100%。

1.2.3响应面试验设计综合单因素影响多糖提取率的试验结果，选择提取温度、酶量、提取时间3个因素，以灵芝多糖的提取率为响应值，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，采用响应面法在3因素3水平上对灵芝多糖的提取条件进行优化。

2结果与分析

在单因素试验基础上，表2中试验1～12 为析因试验，13～17 为中心试验，17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在x1、x2、x3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。对所得数据进行回归分析，分析结果见表3。各因素经回归拟合后，

响应面试验回归模型分析结果

变异源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型项1.8170.26失拟度1.3130.443.480.129 7纯误差0.5040.13总变异20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

得回归方程为：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明该响应面回归模型达到极显著水平；失拟度P=0.129 7>0.05，说明检验结果与模型计算结果没有显著差异。提取温度、酶量、提取时间这3个因素的P值分别为0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，说明这3个因素均对灵芝多糖提取率有显著影响。对各个因素之间的交互作用进行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，说明各个因素之间的交互影响较小。回归方程的相关系数r=0.954 0，说明响应值（提取率）的变化有9540%来源于所选变量（即提取温度、提取时间和酶量）。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

为进一步直观说明提取温度、酶量和提取时间之间的交

互作用及其对多糖提取率的影响，用Design-expert软件对试验数据进行分析，得出响应面和等高线图，通过考察拟合响应面的形状，分析提取温度、酶量、提取时间对灵芝多糖提取率的影响。

多糖提取率在设定范围内随提取

时间延长而增大；而在设定的范围内，多糖提取率随酶量和提取温度增加均是上升后达到一个平衡，即最大值。从经济角度和提取的可行性考虑，将2.5 h定为最适提取时间，最佳提取酶量和提取温度可以由上述方程求导得到，即灵芝多糖提取最佳工艺条件为提取温度50.59 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，在该条件下由响应面模型预测的灵芝多糖提取率的理论值为11.55%。

为了验证试验的可靠性，采用最优提取条件浸提灵芝多糖，考虑到试验操作的可行性，为方便实际操作，将条件修正为提取温度51 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，在此条件下实际提取率11.25%，实际测定值比理论预测值（11.55%）低260%。由此可见，采用响应面分析法优化得到的浸提条件参数准确可靠，具有很好的实际应用价值。

3结论

在单因素试验设计的基础上，通过设计3因素3水平响应面分析法试验，确定灵芝多糖的提取最佳工艺参数为提取温度51 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，按照此工艺提取灵芝多糖的提取率较高，实际提取率可达11.25%。

参考文献：

[1]张志军，李淑芳，魏雪生，等. 灵芝多糖体外抗氧化活性的研究[J]. 化学与生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黄智璇，欧阳蒲月.灵芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李丽，雷林生，余传林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干扰素 γ含量的变化及免疫调节药物的干预作用[J]. 南方医科大学学报，2008，28（1）：65-68.

[4]李建军，雷林生，余传林，等. 灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫学相关性研究[J]. 中药材，2007，30（1）：71-73.

[5]吴锋，孟国梁，杨丽云，等. 灵芝多糖预防大鼠动脉粥样硬化的实验研究[J]. 南通大学学报：医学版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陈锦屏. 油枣多糖的酶法提取及其对多糖分子量分布的影响[J]. 食品科学，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艳，张小杰，王涛，等. 响应面法优化香椿叶多糖的提取条件[J]. 食品科学，2010，31（4）：106-110.任冰如，陈剑，吕寒，等. 红凤菜总黄酮的富集方法[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：260-262.endprint

摘要：根据单因素试验结果，选用提取时间、提取温度、酶量3个反应因素作为研究对象，以多糖提取率为考察指标，通过响应面分析方法优化灵芝多糖的提取工艺条件。结果表明，最佳提取条件为提取温度51 ℃、酶量180%、提取时间2.5 h。在最佳工艺条件下，多糖提取率可达11.25%。

关键词：灵芝多糖；酶法提取；响应面分析

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金项目：江苏农林职业技术学院科技项目（编号：2010c09）。

作者简介：吕兴萍（1981—），女，江苏海安人，硕士，讲师，主要从事中药新剂型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，具有扶正固本等功效。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，具有免疫调节、抗辐射、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等广泛的药理活性[1-5]，因此灵芝多糖是目前灵芝研究的热点之一。目前灵芝多糖的提取方法主要是传统的水提醇沉法，此外还有膜分离法、酶解法、超声法、微波法等。其中，酶解法通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程，较大幅度提高多糖得率，不易破坏多糖的立体结构和生物活性[6]。响应面法以最经济的方式、较少的试验次数和较短的时间对所选的试验参数进行全面研究[7]。本试验拟采取酶解法提取灵芝多糖，以灵芝多糖提取率响应值为研究对象，应用响应面法对灵芝多糖的提取条件进行优化，以期得到灵芝多糖最佳提取工艺参数。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

HY-02型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司），上海菁华754分光光度计，电子天平，HH-S型恒温水浴锅（江苏金坛市金城国盛实验仪器厂），SHZ-IIIB循环式多用真空泵（浙江省临海市谭氏真空设备有限公司）。

灵芝子实体（江苏农林职业技术学院食用菌研究所）；纤维素酶（活性≥400 U/mg）；浓硫酸、苯酚、无水葡萄糖、乙醇均为国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1灵芝多糖的提取将干燥的灵芝切片在高速粉碎机下粉碎至一定粒度，精确称取0.25 g灵芝粉及适量的纤维素酶，加入纯化水在一定温度水浴下酶解提取后，在沸水浴中灭酶4 min，抽滤得灵芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的测定以葡萄糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，并采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，最后根据下式计算灵芝多糖提取率。

多糖提取率=（总糖量-还原糖量）/供试样品量×100%。

1.2.3响应面试验设计综合单因素影响多糖提取率的试验结果，选择提取温度、酶量、提取时间3个因素，以灵芝多糖的提取率为响应值，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，采用响应面法在3因素3水平上对灵芝多糖的提取条件进行优化。

2结果与分析

在单因素试验基础上，表2中试验1～12 为析因试验，13～17 为中心试验，17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在x1、x2、x3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。对所得数据进行回归分析，分析结果见表3。各因素经回归拟合后，

响应面试验回归模型分析结果

变异源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型项1.8170.26失拟度1.3130.443.480.129 7纯误差0.5040.13总变异20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

得回归方程为：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明该响应面回归模型达到极显著水平；失拟度P=0.129 7>0.05，说明检验结果与模型计算结果没有显著差异。提取温度、酶量、提取时间这3个因素的P值分别为0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，说明这3个因素均对灵芝多糖提取率有显著影响。对各个因素之间的交互作用进行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，说明各个因素之间的交互影响较小。回归方程的相关系数r=0.954 0，说明响应值（提取率）的变化有9540%来源于所选变量（即提取温度、提取时间和酶量）。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

为进一步直观说明提取温度、酶量和提取时间之间的交

互作用及其对多糖提取率的影响，用Design-expert软件对试验数据进行分析，得出响应面和等高线图，通过考察拟合响应面的形状，分析提取温度、酶量、提取时间对灵芝多糖提取率的影响。

多糖提取率在设定范围内随提取

时间延长而增大；而在设定的范围内，多糖提取率随酶量和提取温度增加均是上升后达到一个平衡，即最大值。从经济角度和提取的可行性考虑，将2.5 h定为最适提取时间，最佳提取酶量和提取温度可以由上述方程求导得到，即灵芝多糖提取最佳工艺条件为提取温度50.59 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，在该条件下由响应面模型预测的灵芝多糖提取率的理论值为11.55%。

为了验证试验的可靠性，采用最优提取条件浸提灵芝多糖，考虑到试验操作的可行性，为方便实际操作，将条件修正为提取温度51 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，在此条件下实际提取率11.25%，实际测定值比理论预测值（11.55%）低260%。由此可见，采用响应面分析法优化得到的浸提条件参数准确可靠，具有很好的实际应用价值。

3结论

在单因素试验设计的基础上，通过设计3因素3水平响应面分析法试验，确定灵芝多糖的提取最佳工艺参数为提取温度51 ℃、酶量1.80%、提取时间2.5 h，按照此工艺提取灵芝多糖的提取率较高，实际提取率可达11.25%。

参考文献：

[1]张志军，李淑芳，魏雪生，等. 灵芝多糖体外抗氧化活性的研究[J]. 化学与生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黄智璇，欧阳蒲月.灵芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李丽，雷林生，余传林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干扰素 γ含量的变化及免疫调节药物的干预作用[J]. 南方医科大学学报，2008，28（1）：65-68.

[4]李建军，雷林生，余传林，等. 灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫学相关性研究[J]. 中药材，2007，30（1）：71-73.

[5]吴锋，孟国梁，杨丽云，等. 灵芝多糖预防大鼠动脉粥样硬化的实验研究[J]. 南通大学学报：医学版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陈锦屏. 油枣多糖的酶法提取及其对多糖分子量分布的影响[J]. 食品科学，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艳，张小杰，王涛，等. 响应面法优化香椿叶多糖的提取条件[J]. 食品科学，2010，31（4）：106-110.任冰如，陈剑，吕寒，等. 红凤菜总黄酮的富集方法[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：260-262.endprint