仔猪黄白痢灭活疫苗制备及应用

胡辉+邓治邦+苏五珍+等

摘要：从猪场黄白痢仔猪病料中分离出致病性大肠杆菌菌株，研制成仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗，应用于多个发病猪场。结果表明，灭活苗组仔猪发病头数少、病程短、症状轻微。仔猪大肠杆菌灭活苗能明显降低仔猪黄白痢发病率，利用仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗预防仔猪黄白痢效果明显优于基因工程苗。

关键词：仔猪；大肠杆菌；黄白痢；自体灭活菌苗；疫苗

中图分类号： S858.282.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0169-02

收稿日期：2013-09-22

基金项目：湖南省科学计划（编号：2011NK3162）；湖南省教育厅科学研究项目（编号：12C1204）。

作者简介：胡辉（1970—），女，湖南宁远人，副教授，从事动物疫病教学及技术推广工作。E-mail：huhui5909@126.com。

通信作者：胡艳，高级兽医师，从事动物疫病教学及技术推广工作。E-mail：huyan0128@126.com。仔猪黄白痢是由肠毒素型大肠杆菌引起的，以哺乳仔猪排黄色、白色稀便为主要特征，是规模化、集约化大型猪场的常见病[1]。由于引起仔猪黄白痢的大肠杆菌血清型繁多（目前已确定的大肠杆菌O抗原有171 种，K抗原有103种，H抗原有60种），不同地区、不同猪场的致病性大肠杆菌血清型有较大差异，存在一定的区域性，经抗菌药物治疗后患病仔猪血清型还在不断变化[2]。因此，现有疫苗应用效果差异较大，有的猪场免疫效果好，对仔猪保护率高，有的猪场免疫效果差，甚至发生免疫失败[3]。为了有效预防仔猪黄白痢的发生，笔者从猪场黄白痢仔猪病料中分离出致病性大肠杆菌菌株，研制成黄白痢自体灭活菌苗，应用于各发病猪场，观察仔猪黄白痢发病情况，旨在为减少仔猪黄白痢发病率提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试猪选择湖南省怀化市2县2个有典型黄白痢病史的集约化猪场（编号A、B）的妊娠母猪进行试验。

1.1.2疫苗仔猪黄白痢灭活苗由笔者所在实验室研制（病料采自上述2猪场）。 K88、K99 基因工程苗系中国科学院上海生物工程中心研制，批号：090201027。

1.2方法

灭活苗组于母猪产前30、15 d分别按4 mL/头剂量各注射1次黄白痢灭活苗；工程苗组于母猪产前第24天至第21天按说明书要求每头注射基因工程菌苗1头份；对照组母猪不接种任何大肠杆菌疫苗。全部母猪不投喂抗菌药物预防。仔猪出生后每天观察并记录仔猪排粪、发病以及药物治疗等情况，7日龄内不发生黄痢、30日龄内不发生白痢表示预防有效[4]。所有母猪及所产仔猪均按常规方法进行其他疫苗的免疫预防接种。

1.2.1仔猪黄白痢灭活苗的制备将经过鉴定的各猪场仔猪黄白痢致病性大肠杆菌菌株分别接种于基础培养基中，37 ℃ 培养18～24 h后制成菌悬液，经过计数确保菌液浓度为4×109～5×109 CFU/mL，加入0.4%甲醛溶液37 ℃灭活48 h，其间每隔4～5 h摇振1次，再加入菌液体积20%灭菌后的氢氧化铝胶、0.01%硫柳汞，充分振摇，即为自体灭活苗，检验后分装、加盖、密封、贴签，4 ℃保存备用[5]。

1.2.2菌苗安全性检查每批次灭活苗必须经过无菌检验，要求菌苗无任何杂菌污染，划线平板培养基无活菌生长。取4～5只小鼠腹腔注射菌苗0.5 mL/只，设对照组，观察 7～8 d，要求小鼠无异常情况。取体重40 kg以上的健康猪4头，各肌注菌苗10 mL/头，观察7 d，要求无明显不良反应，若菌苗符合以上要求则为安全菌苗[6]。选择妊娠90 d 的母猪2 头，各注射菌苗10 mL/头，观察有无不良反应。将收集自怀化市10个猪场经过分离鉴定的致病性大肠杆菌菌株分别配制成灭活苗，免费应用于各发病猪场，观察应用效果。

2结果与分析

2.1自体灭活菌苗与基因工程苗免疫效果

选择有代表性的2猪场的怀孕母猪，分为3组，分别用基因工程苗、自体灭活苗接种，对照组不作任何处理，观察仔猪黄白痢发病情况。由表1、表2可知，自体灭活苗组仔猪保护率分别为91%、90%，比K88、K99 基因工程苗组高12%和28%，对照组仔猪发病率分别高达47%、51%。自体灭活苗组仔猪发病头数少、病程短、症状轻微易治愈。由此可知，黄白痢自体灭活苗能明显降低仔猪黄白痢发病率，是预防仔猪黄白痢的最佳疫苗。

将上述仔猪黄白痢自体灭活苗免费分别应用于怀化市芷江侗族自治县、洪江市、沅陵县、溆浦县等地十几个集约化猪场，共计6 L，免疫母猪达1 000余头。对部分猪场抽样并测定，免疫接种后，仔猪保护率均达90%以上。

3结论与讨论

3.1黄白痢自体灭活菌苗效果

本研究表明，笔者所制菌苗免疫效果比较理想，具有推广应用价值。利用仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗预防仔猪黄白痢的效果明显优于基因工程苗，这可能与自体苗与猪场大肠杆菌菌型高度一致有关。本试验选用的K88、K99基因工程苗对B猪场预防仔猪黄白痢效果差，这可能与长途运输、售发保存条件及疫苗与猪场病原菌血清型不符有关[7]。

3.2研制多价菌苗

任何单一抗原均很难诱导全面有效的免疫保护作用，成功的仔猪大肠杆菌疫苗应该是多价联苗[8]。多价菌苗虽能很好地预防仔猪黄白痢的发生，但大肠杆菌致病性血清型众多。将所有的多价菌苗商品化难度较大，故而在黄白痢多发猪场应用自体菌苗是1种有效的控制方法，同时也可以降低生产成本。

3.3加强饲养管理与兽医卫生

黄白痢免疫效果与饲养管理方式、猪场卫生状况关系密切，引起仔猪大肠杆菌病的因素很多，对本病的防治，除了应用相应的大肠杆菌灭活苗进行免疫预防接种外，还应采取加强管理、控制环境条件、提高饲料品质、选择特效药物进行治疗等综合防制措施[9]。

参考文献：

[1]蔡宝祥. 家畜传染病学[M]. 3版.北京：中国农业出版社，2004.

[2]石爱华. 仔猪黄白痢的调查与防治[J]. 甘肃畜牧兽医，2003，33（1）：28-29.

[3]黎满香，宁玲忠，董伟. 湖南猪致病性大肠杆菌的分离及药物敏感性监测[J]. 畜牧兽医杂志，2005，24（1）：6-8.

[4]胡辉. 仔猪大肠杆菌多价基因工程苗推广应用试验[J]. 湖北畜牧兽医，2007（6）：26-27.

[5]马海利，李永强，王瑞吉，等. 仔猪黄白痢大肠杆菌灭活苗的研制与应用[J]. 养猪，1995（3）：38-39.

[6]王多福，魏玉明，冯国延.仔猪大肠杆菌灭活苗的研制及效果观察[J]. 中国动物检疫，2005，17（5）：29-30.

[7]熊忠良，周绍凤，宋如锡，等. 仔猪黄白痢自体灭活菌苗的研制与应用效果观察[J]. 甘肃畜牧兽医，2000，30（6）：4-6.

[8]孙宇，沈玉春. 仔猪大肠杆菌K88-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的应用实验[J]. 中国兽药杂志，2002，36（9）：35-36.

[9]彦桂军，丁家波，周明荣. 仔猪大肠杆菌四价提纯苗对仔猪黄痢的预防效果[J]. 中国兽医学报，2000，20（4）：371，413.李娜，张保平，王文彬，等. 常德地区鸡场致病性大肠杆菌血清型鉴定[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：171-172.

摘要：从猪场黄白痢仔猪病料中分离出致病性大肠杆菌菌株，研制成仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗，应用于多个发病猪场。结果表明，灭活苗组仔猪发病头数少、病程短、症状轻微。仔猪大肠杆菌灭活苗能明显降低仔猪黄白痢发病率，利用仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗预防仔猪黄白痢效果明显优于基因工程苗。

关键词：仔猪；大肠杆菌；黄白痢；自体灭活菌苗；疫苗

中图分类号： S858.282.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0169-02

收稿日期：2013-09-22

基金项目：湖南省科学计划（编号：2011NK3162）；湖南省教育厅科学研究项目（编号：12C1204）。

作者简介：胡辉（1970—），女，湖南宁远人，副教授，从事动物疫病教学及技术推广工作。E-mail：huhui5909@126.com。

通信作者：胡艳，高级兽医师，从事动物疫病教学及技术推广工作。E-mail：huyan0128@126.com。仔猪黄白痢是由肠毒素型大肠杆菌引起的，以哺乳仔猪排黄色、白色稀便为主要特征，是规模化、集约化大型猪场的常见病[1]。由于引起仔猪黄白痢的大肠杆菌血清型繁多（目前已确定的大肠杆菌O抗原有171 种，K抗原有103种，H抗原有60种），不同地区、不同猪场的致病性大肠杆菌血清型有较大差异，存在一定的区域性，经抗菌药物治疗后患病仔猪血清型还在不断变化[2]。因此，现有疫苗应用效果差异较大，有的猪场免疫效果好，对仔猪保护率高，有的猪场免疫效果差，甚至发生免疫失败[3]。为了有效预防仔猪黄白痢的发生，笔者从猪场黄白痢仔猪病料中分离出致病性大肠杆菌菌株，研制成黄白痢自体灭活菌苗，应用于各发病猪场，观察仔猪黄白痢发病情况，旨在为减少仔猪黄白痢发病率提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试猪选择湖南省怀化市2县2个有典型黄白痢病史的集约化猪场（编号A、B）的妊娠母猪进行试验。

1.1.2疫苗仔猪黄白痢灭活苗由笔者所在实验室研制（病料采自上述2猪场）。 K88、K99 基因工程苗系中国科学院上海生物工程中心研制，批号：090201027。

1.2方法

灭活苗组于母猪产前30、15 d分别按4 mL/头剂量各注射1次黄白痢灭活苗；工程苗组于母猪产前第24天至第21天按说明书要求每头注射基因工程菌苗1头份；对照组母猪不接种任何大肠杆菌疫苗。全部母猪不投喂抗菌药物预防。仔猪出生后每天观察并记录仔猪排粪、发病以及药物治疗等情况，7日龄内不发生黄痢、30日龄内不发生白痢表示预防有效[4]。所有母猪及所产仔猪均按常规方法进行其他疫苗的免疫预防接种。

1.2.1仔猪黄白痢灭活苗的制备将经过鉴定的各猪场仔猪黄白痢致病性大肠杆菌菌株分别接种于基础培养基中，37 ℃ 培养18～24 h后制成菌悬液，经过计数确保菌液浓度为4×109～5×109 CFU/mL，加入0.4%甲醛溶液37 ℃灭活48 h，其间每隔4～5 h摇振1次，再加入菌液体积20%灭菌后的氢氧化铝胶、0.01%硫柳汞，充分振摇，即为自体灭活苗，检验后分装、加盖、密封、贴签，4 ℃保存备用[5]。

1.2.2菌苗安全性检查每批次灭活苗必须经过无菌检验，要求菌苗无任何杂菌污染，划线平板培养基无活菌生长。取4～5只小鼠腹腔注射菌苗0.5 mL/只，设对照组，观察 7～8 d，要求小鼠无异常情况。取体重40 kg以上的健康猪4头，各肌注菌苗10 mL/头，观察7 d，要求无明显不良反应，若菌苗符合以上要求则为安全菌苗[6]。选择妊娠90 d 的母猪2 头，各注射菌苗10 mL/头，观察有无不良反应。将收集自怀化市10个猪场经过分离鉴定的致病性大肠杆菌菌株分别配制成灭活苗，免费应用于各发病猪场，观察应用效果。

2结果与分析

2.1自体灭活菌苗与基因工程苗免疫效果

选择有代表性的2猪场的怀孕母猪，分为3组，分别用基因工程苗、自体灭活苗接种，对照组不作任何处理，观察仔猪黄白痢发病情况。由表1、表2可知，自体灭活苗组仔猪保护率分别为91%、90%，比K88、K99 基因工程苗组高12%和28%，对照组仔猪发病率分别高达47%、51%。自体灭活苗组仔猪发病头数少、病程短、症状轻微易治愈。由此可知，黄白痢自体灭活苗能明显降低仔猪黄白痢发病率，是预防仔猪黄白痢的最佳疫苗。

将上述仔猪黄白痢自体灭活苗免费分别应用于怀化市芷江侗族自治县、洪江市、沅陵县、溆浦县等地十几个集约化猪场，共计6 L，免疫母猪达1 000余头。对部分猪场抽样并测定，免疫接种后，仔猪保护率均达90%以上。

3结论与讨论

3.1黄白痢自体灭活菌苗效果

本研究表明，笔者所制菌苗免疫效果比较理想，具有推广应用价值。利用仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗预防仔猪黄白痢的效果明显优于基因工程苗，这可能与自体苗与猪场大肠杆菌菌型高度一致有关。本试验选用的K88、K99基因工程苗对B猪场预防仔猪黄白痢效果差，这可能与长途运输、售发保存条件及疫苗与猪场病原菌血清型不符有关[7]。

3.2研制多价菌苗

任何单一抗原均很难诱导全面有效的免疫保护作用，成功的仔猪大肠杆菌疫苗应该是多价联苗[8]。多价菌苗虽能很好地预防仔猪黄白痢的发生，但大肠杆菌致病性血清型众多。将所有的多价菌苗商品化难度较大，故而在黄白痢多发猪场应用自体菌苗是1种有效的控制方法，同时也可以降低生产成本。

3.3加强饲养管理与兽医卫生

黄白痢免疫效果与饲养管理方式、猪场卫生状况关系密切，引起仔猪大肠杆菌病的因素很多，对本病的防治，除了应用相应的大肠杆菌灭活苗进行免疫预防接种外，还应采取加强管理、控制环境条件、提高饲料品质、选择特效药物进行治疗等综合防制措施[9]。

参考文献：

[1]蔡宝祥. 家畜传染病学[M]. 3版.北京：中国农业出版社，2004.

[2]石爱华. 仔猪黄白痢的调查与防治[J]. 甘肃畜牧兽医，2003，33（1）：28-29.

[3]黎满香，宁玲忠，董伟. 湖南猪致病性大肠杆菌的分离及药物敏感性监测[J]. 畜牧兽医杂志，2005，24（1）：6-8.

[4]胡辉. 仔猪大肠杆菌多价基因工程苗推广应用试验[J]. 湖北畜牧兽医，2007（6）：26-27.

[5]马海利，李永强，王瑞吉，等. 仔猪黄白痢大肠杆菌灭活苗的研制与应用[J]. 养猪，1995（3）：38-39.

[6]王多福，魏玉明，冯国延.仔猪大肠杆菌灭活苗的研制及效果观察[J]. 中国动物检疫，2005，17（5）：29-30.

[7]熊忠良，周绍凤，宋如锡，等. 仔猪黄白痢自体灭活菌苗的研制与应用效果观察[J]. 甘肃畜牧兽医，2000，30（6）：4-6.

[8]孙宇，沈玉春. 仔猪大肠杆菌K88-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的应用实验[J]. 中国兽药杂志，2002，36（9）：35-36.

[9]彦桂军，丁家波，周明荣. 仔猪大肠杆菌四价提纯苗对仔猪黄痢的预防效果[J]. 中国兽医学报，2000，20（4）：371，413.李娜，张保平，王文彬，等. 常德地区鸡场致病性大肠杆菌血清型鉴定[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：171-172.

摘要：从猪场黄白痢仔猪病料中分离出致病性大肠杆菌菌株，研制成仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗，应用于多个发病猪场。结果表明，灭活苗组仔猪发病头数少、病程短、症状轻微。仔猪大肠杆菌灭活苗能明显降低仔猪黄白痢发病率，利用仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗预防仔猪黄白痢效果明显优于基因工程苗。

关键词：仔猪；大肠杆菌；黄白痢；自体灭活菌苗；疫苗

中图分类号： S858.282.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0169-02

收稿日期：2013-09-22

基金项目：湖南省科学计划（编号：2011NK3162）；湖南省教育厅科学研究项目（编号：12C1204）。

作者简介：胡辉（1970—），女，湖南宁远人，副教授，从事动物疫病教学及技术推广工作。E-mail：huhui5909@126.com。

通信作者：胡艳，高级兽医师，从事动物疫病教学及技术推广工作。E-mail：huyan0128@126.com。仔猪黄白痢是由肠毒素型大肠杆菌引起的，以哺乳仔猪排黄色、白色稀便为主要特征，是规模化、集约化大型猪场的常见病[1]。由于引起仔猪黄白痢的大肠杆菌血清型繁多（目前已确定的大肠杆菌O抗原有171 种，K抗原有103种，H抗原有60种），不同地区、不同猪场的致病性大肠杆菌血清型有较大差异，存在一定的区域性，经抗菌药物治疗后患病仔猪血清型还在不断变化[2]。因此，现有疫苗应用效果差异较大，有的猪场免疫效果好，对仔猪保护率高，有的猪场免疫效果差，甚至发生免疫失败[3]。为了有效预防仔猪黄白痢的发生，笔者从猪场黄白痢仔猪病料中分离出致病性大肠杆菌菌株，研制成黄白痢自体灭活菌苗，应用于各发病猪场，观察仔猪黄白痢发病情况，旨在为减少仔猪黄白痢发病率提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试猪选择湖南省怀化市2县2个有典型黄白痢病史的集约化猪场（编号A、B）的妊娠母猪进行试验。

1.1.2疫苗仔猪黄白痢灭活苗由笔者所在实验室研制（病料采自上述2猪场）。 K88、K99 基因工程苗系中国科学院上海生物工程中心研制，批号：090201027。

1.2方法

灭活苗组于母猪产前30、15 d分别按4 mL/头剂量各注射1次黄白痢灭活苗；工程苗组于母猪产前第24天至第21天按说明书要求每头注射基因工程菌苗1头份；对照组母猪不接种任何大肠杆菌疫苗。全部母猪不投喂抗菌药物预防。仔猪出生后每天观察并记录仔猪排粪、发病以及药物治疗等情况，7日龄内不发生黄痢、30日龄内不发生白痢表示预防有效[4]。所有母猪及所产仔猪均按常规方法进行其他疫苗的免疫预防接种。

1.2.1仔猪黄白痢灭活苗的制备将经过鉴定的各猪场仔猪黄白痢致病性大肠杆菌菌株分别接种于基础培养基中，37 ℃ 培养18～24 h后制成菌悬液，经过计数确保菌液浓度为4×109～5×109 CFU/mL，加入0.4%甲醛溶液37 ℃灭活48 h，其间每隔4～5 h摇振1次，再加入菌液体积20%灭菌后的氢氧化铝胶、0.01%硫柳汞，充分振摇，即为自体灭活苗，检验后分装、加盖、密封、贴签，4 ℃保存备用[5]。

1.2.2菌苗安全性检查每批次灭活苗必须经过无菌检验，要求菌苗无任何杂菌污染，划线平板培养基无活菌生长。取4～5只小鼠腹腔注射菌苗0.5 mL/只，设对照组，观察 7～8 d，要求小鼠无异常情况。取体重40 kg以上的健康猪4头，各肌注菌苗10 mL/头，观察7 d，要求无明显不良反应，若菌苗符合以上要求则为安全菌苗[6]。选择妊娠90 d 的母猪2 头，各注射菌苗10 mL/头，观察有无不良反应。将收集自怀化市10个猪场经过分离鉴定的致病性大肠杆菌菌株分别配制成灭活苗，免费应用于各发病猪场，观察应用效果。

2结果与分析

2.1自体灭活菌苗与基因工程苗免疫效果

选择有代表性的2猪场的怀孕母猪，分为3组，分别用基因工程苗、自体灭活苗接种，对照组不作任何处理，观察仔猪黄白痢发病情况。由表1、表2可知，自体灭活苗组仔猪保护率分别为91%、90%，比K88、K99 基因工程苗组高12%和28%，对照组仔猪发病率分别高达47%、51%。自体灭活苗组仔猪发病头数少、病程短、症状轻微易治愈。由此可知，黄白痢自体灭活苗能明显降低仔猪黄白痢发病率，是预防仔猪黄白痢的最佳疫苗。

将上述仔猪黄白痢自体灭活苗免费分别应用于怀化市芷江侗族自治县、洪江市、沅陵县、溆浦县等地十几个集约化猪场，共计6 L，免疫母猪达1 000余头。对部分猪场抽样并测定，免疫接种后，仔猪保护率均达90%以上。

3结论与讨论

3.1黄白痢自体灭活菌苗效果

本研究表明，笔者所制菌苗免疫效果比较理想，具有推广应用价值。利用仔猪大肠杆菌自体灭活菌苗预防仔猪黄白痢的效果明显优于基因工程苗，这可能与自体苗与猪场大肠杆菌菌型高度一致有关。本试验选用的K88、K99基因工程苗对B猪场预防仔猪黄白痢效果差，这可能与长途运输、售发保存条件及疫苗与猪场病原菌血清型不符有关[7]。

3.2研制多价菌苗

任何单一抗原均很难诱导全面有效的免疫保护作用，成功的仔猪大肠杆菌疫苗应该是多价联苗[8]。多价菌苗虽能很好地预防仔猪黄白痢的发生，但大肠杆菌致病性血清型众多。将所有的多价菌苗商品化难度较大，故而在黄白痢多发猪场应用自体菌苗是1种有效的控制方法，同时也可以降低生产成本。

3.3加强饲养管理与兽医卫生

黄白痢免疫效果与饲养管理方式、猪场卫生状况关系密切，引起仔猪大肠杆菌病的因素很多，对本病的防治，除了应用相应的大肠杆菌灭活苗进行免疫预防接种外，还应采取加强管理、控制环境条件、提高饲料品质、选择特效药物进行治疗等综合防制措施[9]。

参考文献：

[1]蔡宝祥. 家畜传染病学[M]. 3版.北京：中国农业出版社，2004.

[2]石爱华. 仔猪黄白痢的调查与防治[J]. 甘肃畜牧兽医，2003，33（1）：28-29.

[3]黎满香，宁玲忠，董伟. 湖南猪致病性大肠杆菌的分离及药物敏感性监测[J]. 畜牧兽医杂志，2005，24（1）：6-8.

[4]胡辉. 仔猪大肠杆菌多价基因工程苗推广应用试验[J]. 湖北畜牧兽医，2007（6）：26-27.

[5]马海利，李永强，王瑞吉，等. 仔猪黄白痢大肠杆菌灭活苗的研制与应用[J]. 养猪，1995（3）：38-39.

[6]王多福，魏玉明，冯国延.仔猪大肠杆菌灭活苗的研制及效果观察[J]. 中国动物检疫，2005，17（5）：29-30.

[7]熊忠良，周绍凤，宋如锡，等. 仔猪黄白痢自体灭活菌苗的研制与应用效果观察[J]. 甘肃畜牧兽医，2000，30（6）：4-6.

[8]孙宇，沈玉春. 仔猪大肠杆菌K88-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的应用实验[J]. 中国兽药杂志，2002，36（9）：35-36.

[9]彦桂军，丁家波，周明荣. 仔猪大肠杆菌四价提纯苗对仔猪黄痢的预防效果[J]. 中国兽医学报，2000，20（4）：371，413.李娜，张保平，王文彬，等. 常德地区鸡场致病性大肠杆菌血清型鉴定[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：171-172.