4个中药复方对鸡胚成纤维细胞的安全浓度和生长的影响

邢玉娟+陈茜+陈玉库+等

摘要：将氧化苦参碱（OM）-黄芪多糖（APS）、OM-APS-栀子苷（GP）、甘草酸（GA）-APS和GA-APS-GP 等4个中药复方分别用MEM培养液溶解倍比稀释成1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μg/mL 等10个浓度，再分别加入到培养24 h且已经长成单层鸡胚成纤维细胞（CEF）的培养体系中，通过MTT法测定4个中药复方对鸡胚成纤维细胞增殖的影响。结果表明，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS-GP对CEF的安全浓度均为1 000 μg/mL，GA-APS为500 μg/mL；OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS在500～1.96 μg/mL，GA-APS-GP在500～3.92 μg/mL浓度范围内对CEF生长均有明显的促进作用，作用最强的是OM-APS-GP，其次是OM-APS、GA-APS和GA-APS-GP。

关键词：中药复方；鸡胚成纤维细胞；生长；安全浓度

中图分类号：S853.74文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）06-0149-03

收稿日期：2013-09-06

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2008BADB4B06）；江苏青蓝工程骨干教师资助项目。

作者简介：邢玉娟（1964—），女，山东济南人，副教授，主要从事中药药理研究。E-mail：1903048595@qq.com。

通信作者：胡元亮，教授，博士生导师，主要从事中兽医学研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn。有研究证明，中药为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类和铝胶类化学佐剂副作用大、局部刺激性强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-2]，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌[3-4]。

有试验证明，氧化苦参碱（oxymatrine，OM）和黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）在先于病毒加入细胞、后于病毒加入细胞和与病毒同时加入细胞等3种方式加入后均能抑制病毒生长，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在先于病毒加入和与病毒同时加入时有抑制病毒生长作用，栀子苷（geniposide，GP）只有在先于病毒加入时才能显现出一定的抑制病毒感染细胞能力的作用[5-6]。本试验选用体外试验对鸡新城疫病毒（NDV）呈现抑制作用的OM、APS、GP和GA，按一定比例分别组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等4个中药复方，通过MTT（四唑溴盐）法[7-11]测定4个中药复方对鸡胚成纤维细胞（chickembryo fibroblast，CEF）增殖的影响，为下一步体内试验作准备。

1材料与方法

1.1试验药物

根据以前的试验结果[5]，将OM、GA、GP、APS 等4种中药按一定比例组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等 4个复方，分别用MEM培养液溶解稀释成1 000 μg/mL，高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。临用前吸取各药0.5 mL至24孔细胞培养板第1孔中，加入细胞维持液 0.5 mL，倍比稀释至10孔。

1.2主要试剂

MEM细胞培养液，Gibco公司产品，按说明书配制，再加入犊牛血清（5%为细胞生长液、2%为细胞维持液），再按常规量加入0.03%谷胺酰氨和双抗（各100 IU/mL）；胰蛋白酶，进口分装，用PBS（pH值7.4）配制成0.25%的溶液，0.22 μm 混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用；MTT溶液，Sigma公司产品，用pH值为7.4的PBS液配制，使终浓度为2 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4 ℃冰箱保存，1 周内用完；裂解液二甲亚砜（DMSO），分析纯，江苏苏州工业园区正兴化工研究院生产。

1.3主要仪器

CO2培养箱，美国Revco公司生产；XSZ-DZ型倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；DG3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂制造；75-2A型微量振荡器，上海医用分析仪器厂生产；96 孔细胞培养板和24 孔细胞培养板，德国 Nunclon 公司生产。

1.4试验方法

按文献[12-13]的方法制备CEF。用细胞生长液调整细胞数至100万个/mL，在96 孔细胞培养板中加入 100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，待CEF刚形成单层时加药。试验组分别加入不同浓度的中药复方 100 μL/孔，每个浓度重复4 孔，每2种中药成分复方共用一块细胞板并重复2块细胞板；对照组4 孔，仅加细胞维持液；另设无细胞孔为测定时的空白调零孔，继续培养。加药后 48 h 测定细胞增殖情况。

1.5细胞增殖测定

用MTT法测定细胞增殖的情况：测定前4 h加入 50 μL/孔 MTT溶液；测定时快速翻转培养板，甩去孔内培养液，加入100 μL/孔裂解液，室温下振荡5 min使结晶物溶解；然后用酶联免疫检测仪测定D570 nm，作为细胞增殖的指标。D570 nm与活细胞的增殖呈正比，即D570 nm越大，细胞增殖越旺盛。

1.6中药对CEF安全浓度的判定

根据D570 nm测定结果判定中药对CEF的安全浓度，选择D570 nm与对照差异不显著的试验组的最高中药浓度作为安全浓度的上限[14]。

1.7数据处理

计算4 孔平均值和标准差，数据以“x±s”表示，用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较，并比较各中药组分对CEF增殖率的差异性。增殖率=（各组加药后的D570 nm-对照的D570 nm）/对照的D570 nm×100%。

2结果与分析

2.14个中药复方对CEF增殖的影响

3.91～31.25 μg/mL OM-APS 的D570 nm显著高于对照（P<0.05），1.95、62.50～500.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL OM-APS的D570 mm低于对照但不显著（P>0.05）。说明OM-APS浓度在3.91～3125 μg/mL时对细胞增殖有显著的促进作用。综合以上结果可知，OM-APS的最大安全浓度为1 000.00 μg/mL（表1）。表14个中药复方对CEF增殖的影响

浓度

（μg/mL）D570 nmOM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.000.305±0.005d0.313±0.015c0.332±0.009e0.325±0.020d500.000.345±0.051bc0.367±0.015b0.365±0.019cd0.372±0.017bc250.000.370±0.014abc0.388±0.013ab0.365±0.012cd0.375±0.023bc125.000.370±0.008abc0.387±0.006ab0.366±0.015cd0.388±0.017ab62.500.373±0.015abc0.383±0.015ab0.380±0.010abcd0.412±0.009a31.250.380±0.01ab0.380±0.010ab0.376±0.015bcd0.392±0.005ab15.620.380±0.010ab0.400±0.010a0.386±0.015abc0.382±0.026abc7.810.382±0.020ab0.370±0.010b0.403±0.005a0.360±0.008bc3.910.393±0.017a0.380±0.010ab0.400±0.008ab0.372±0.017bc1.950.372±0.012abc0.366±0.005b0.375±0.012bcd0.347±0.053cd对照0.336±0.028cd0.336±0.028c0.356±0.022d0.356±0.022bcd注：同列数据后不同字母者表示差异显著（P<0.05）。

1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm均显著高于对照，1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）。说明OM-APS-GP在1.95～500.00 μg/mL 时对细胞增殖有促进作用，OM-APS-GP的最大安全浓度为1 000 μg/mL（表1）。

3.91～15.62 μg/mL GA-APS的D570 nm显著高于对照（P<0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的 D570 nm显著低于对照，1.95、31.25～500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05）。说明GA-APS在3.91～15.62 μg/mL能显著促进细胞增殖，但随浓度升高，促进增殖作用逐渐减弱，1 000.00 μg/mL 对细胞增殖有抑制作用。综合以上结果可知，GA-APS最大安全浓度为500.00 μg/mL（表1）。

62.50 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），125.00～500.00、3.91～31.25 μg/mL 的 D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1.95、1 000.00 μg/mL 的 D570 nm 低于对照但不显著。说明62.50 μg/mL GA-APS-GP对细胞增殖有显著的促进作用，且随浓度的升高或降低，促进增殖作用逐渐减弱。综合以上结果可知，GA-APS-GP最大安全浓度为1 000.00 μg/mL（表1）。

2.24个复方对CEF增殖率的影响

对CEF增殖率最高的是OM-APS-GP，当其浓度为 15.62 μg/mL 时增殖率达到19.05%。OM-APS有8个浓度、OM-APS-GP有7个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2个浓度使CEF增殖率达到了10%以上（表2）。

OM-APS促进CEF生长的作用曲线呈马鞍形，有2个峰值，分别是3.91、250.00 μg/mL；OM-APS-GP的促生长曲线呈驼峰形，有3个峰值，分别是3.91、15.62、250.00 μg/mL；GA-APS的促生长曲线呈驼峰形，有3个峰值，分别是7.81、62.50、500.00 μg/mL；GA-APS-GP 的促生长曲线呈单峰状，在62.50 μg/mL达到峰值。

表24个中药复方对CEF增殖率的影响

浓度

（μg/mL）增殖率（%）OM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.00-9.23-6.85-6.74-8.71500.002.689.232.534.49250.0010.1215.482.535.34125.0010.1215.182.818.9962.5011.0113.996.7415.7331.2513.1013.105.6210.1115.6213.1019.058.437.307.8113.6910.1213.201.123.9116.9613.1012.364.491.9510.718.935.34-2.53对照0000

3结论与讨论

3.1中药复方对CEF的安全浓度

根据D570 nm测定结果可知，1 000.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）；500.00～1.95 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm均显著高于对照（P<005），1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）；500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的D570 nm显著低于对照（P<0.05）；500.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm低于对照但不显著。综合以上结果可知，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS、GA-APS-GP 对CEF的安全浓度分别为1 000.00、1 000.00、500.00、1 000.00 μg/mL。

3.2中药复方对CEF增殖的影响

D570 nm能直接反映被测样品中活细胞的增殖情况，两者呈正相关。本试验中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），说明这4个中药复方在一定的浓度范围内均能促进CEF增殖。其中，OM-APS-GP促进CEF增殖的浓度范围最大，所选浓度范围对细胞生长均无抑制作用。综合增殖率和D570 nm 结果可知，这4 个中药复方促进CEF增殖作用的强弱依次为OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中药复方促进CEF生长的量效关系

从试验结果还可以看出，4个中药复方在高浓度（1 000.00 μg/mL）时对细胞生长均起抑制作用，随着浓度的降低，表现出促进生长的作用，但这种促进增殖的作用在达到峰值后又逐渐减弱，说明中药复方促进细胞增殖要有合适的浓度[15]。

本试验中OM-APS有8 个浓度、OM-APS-GP有7 个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 个浓度对CEF增殖率达到了10%以上，在前面的试验中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 个浓度达到10%以上，说明复方促进细胞生长作用优于单体，发挥了协同作用，这和王德云等的研究结果[16-17]一致。

参考文献：

[1]韩庆功，崔艳红，赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用[J]. 兽药与饲料添加剂，2006，11（2）：19-22.

[2]龚晓明，吴耀妹. 免疫佐剂研究的现状与趋势[J]. 中国兽药杂志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振环，胡元亮，马霞，等. 硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 南京农业大学学报，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陈玉库，邢玉娟，蔡丙严，等. 氧化苦参碱等七种中药成分对单层鸡胚成纤维细胞增殖的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陈玉库，胡元亮，等. 7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J]. 中国兽医杂志，2011，9（9）：46-49.

[7]刘钊，杨占秋，肖红，等. MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J]. 武汉大学学报：医学版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]许斌，周双宬，黄玉仙，等. 氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒学报，2006，22（5）：369-374.

[9]程宝莺. 动物细胞培养技术[M]. 广州：华南理工大学出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，刘家国，等. 黄芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿总黄酮对新城疫病毒感染细胞的影响[J]. 南京农业大学学报，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中药成分与新城疫病毒感作后对病毒感染活性的影响[J]. 南京农业大学学报，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，莱因万德L A.细胞实验指南：上册[M]. 黄培堂，译.北京：科学出版社，2001.

[13]辛华. 细胞生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2001.

[14]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京：科学出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10种中药成分对CEF的增殖和抵抗NDV感染的影响[J]. 畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孙峻岭，等. 复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响[J]. 中国兽医学报，2006，26（2）：194-196.

[17]孙峻岭，薛家宾，胡元亮，等. 中药成分复方的佐剂作用及其与中药复方的功效比较[J]. 南京农业大学学报，2005，28（4）：109-112.金穗华，王振云，李慧. 家畜精子形态的判别与描述[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：152-156.

3.2中药复方对CEF增殖的影响

D570 nm能直接反映被测样品中活细胞的增殖情况，两者呈正相关。本试验中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），说明这4个中药复方在一定的浓度范围内均能促进CEF增殖。其中，OM-APS-GP促进CEF增殖的浓度范围最大，所选浓度范围对细胞生长均无抑制作用。综合增殖率和D570 nm 结果可知，这4 个中药复方促进CEF增殖作用的强弱依次为OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中药复方促进CEF生长的量效关系

从试验结果还可以看出，4个中药复方在高浓度（1 000.00 μg/mL）时对细胞生长均起抑制作用，随着浓度的降低，表现出促进生长的作用，但这种促进增殖的作用在达到峰值后又逐渐减弱，说明中药复方促进细胞增殖要有合适的浓度[15]。

本试验中OM-APS有8 个浓度、OM-APS-GP有7 个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 个浓度对CEF增殖率达到了10%以上，在前面的试验中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 个浓度达到10%以上，说明复方促进细胞生长作用优于单体，发挥了协同作用，这和王德云等的研究结果[16-17]一致。

参考文献：

[1]韩庆功，崔艳红，赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用[J]. 兽药与饲料添加剂，2006，11（2）：19-22.

[2]龚晓明，吴耀妹. 免疫佐剂研究的现状与趋势[J]. 中国兽药杂志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振环，胡元亮，马霞，等. 硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 南京农业大学学报，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陈玉库，邢玉娟，蔡丙严，等. 氧化苦参碱等七种中药成分对单层鸡胚成纤维细胞增殖的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陈玉库，胡元亮，等. 7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J]. 中国兽医杂志，2011，9（9）：46-49.

[7]刘钊，杨占秋，肖红，等. MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J]. 武汉大学学报：医学版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]许斌，周双宬，黄玉仙，等. 氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒学报，2006，22（5）：369-374.

[9]程宝莺. 动物细胞培养技术[M]. 广州：华南理工大学出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，刘家国，等. 黄芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿总黄酮对新城疫病毒感染细胞的影响[J]. 南京农业大学学报，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中药成分与新城疫病毒感作后对病毒感染活性的影响[J]. 南京农业大学学报，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，莱因万德L A.细胞实验指南：上册[M]. 黄培堂，译.北京：科学出版社，2001.

[13]辛华. 细胞生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2001.

[14]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京：科学出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10种中药成分对CEF的增殖和抵抗NDV感染的影响[J]. 畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孙峻岭，等. 复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响[J]. 中国兽医学报，2006，26（2）：194-196.

[17]孙峻岭，薛家宾，胡元亮，等. 中药成分复方的佐剂作用及其与中药复方的功效比较[J]. 南京农业大学学报，2005，28（4）：109-112.金穗华，王振云，李慧. 家畜精子形态的判别与描述[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：152-156.

3.2中药复方对CEF增殖的影响

D570 nm能直接反映被测样品中活细胞的增殖情况，两者呈正相关。本试验中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），说明这4个中药复方在一定的浓度范围内均能促进CEF增殖。其中，OM-APS-GP促进CEF增殖的浓度范围最大，所选浓度范围对细胞生长均无抑制作用。综合增殖率和D570 nm 结果可知，这4 个中药复方促进CEF增殖作用的强弱依次为OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中药复方促进CEF生长的量效关系

从试验结果还可以看出，4个中药复方在高浓度（1 000.00 μg/mL）时对细胞生长均起抑制作用，随着浓度的降低，表现出促进生长的作用，但这种促进增殖的作用在达到峰值后又逐渐减弱，说明中药复方促进细胞增殖要有合适的浓度[15]。

本试验中OM-APS有8 个浓度、OM-APS-GP有7 个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 个浓度对CEF增殖率达到了10%以上，在前面的试验中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 个浓度达到10%以上，说明复方促进细胞生长作用优于单体，发挥了协同作用，这和王德云等的研究结果[16-17]一致。

参考文献：

[1]韩庆功，崔艳红，赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用[J]. 兽药与饲料添加剂，2006，11（2）：19-22.

[2]龚晓明，吴耀妹. 免疫佐剂研究的现状与趋势[J]. 中国兽药杂志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振环，胡元亮，马霞，等. 硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 南京农业大学学报，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陈玉库，邢玉娟，蔡丙严，等. 氧化苦参碱等七种中药成分对单层鸡胚成纤维细胞增殖的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陈玉库，胡元亮，等. 7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J]. 中国兽医杂志，2011，9（9）：46-49.

[7]刘钊，杨占秋，肖红，等. MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J]. 武汉大学学报：医学版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]许斌，周双宬，黄玉仙，等. 氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒学报，2006，22（5）：369-374.

[9]程宝莺. 动物细胞培养技术[M]. 广州：华南理工大学出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，刘家国，等. 黄芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿总黄酮对新城疫病毒感染细胞的影响[J]. 南京农业大学学报，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中药成分与新城疫病毒感作后对病毒感染活性的影响[J]. 南京农业大学学报，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，莱因万德L A.细胞实验指南：上册[M]. 黄培堂，译.北京：科学出版社，2001.

[13]辛华. 细胞生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2001.

[14]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京：科学出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10种中药成分对CEF的增殖和抵抗NDV感染的影响[J]. 畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孙峻岭，等. 复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响[J]. 中国兽医学报，2006，26（2）：194-196.

[17]孙峻岭，薛家宾，胡元亮，等. 中药成分复方的佐剂作用及其与中药复方的功效比较[J]. 南京农业大学学报，2005，28（4）：109-112.金穗华，王振云，李慧. 家畜精子形态的判别与描述[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：152-156.