烟草青枯病菌土壤拮抗细菌的筛选及鉴定

陆铮铮+蒋选利

摘要：为筛选出烟草青枯病菌的拮抗细菌，从贵州省天柱县、黄平县及大方县烟草根围土壤中共分离出65株细菌。采用平板喷雾法筛选获得20株拮抗细菌，且抑制效果稳定，其中有2株拮抗细菌平均抑菌圈直径大于20 mm，分别为C3-5（39.98 mm）和C5-3（48.88 mm）。采用16S rDNA序列分析以及形态特征、培养性状、染色结果等方法进行鉴定，结果显示，C3-5为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），C5-3为球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericu）。

关键词：烟草青枯病；拮抗细菌；生物防治；筛选；鉴定；蜡样芽孢杆菌；球形赖氨酸芽孢杆菌

中图分类号： S435.72文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0099-03

收稿日期：2013-09-22

基金项目：中国烟草总公司贵州省公司科技项目（编号：200917）；贵州铜仁地区烟草公司项目[编号：贵铜烟（2009）10]。

作者简介：陆铮铮（1986—），女，硕士，助教，研究方向为植物病害生物防治。E-mail：luzheng_zheng@126.com。

通信作者：蒋选利，教授，博士生导师，研究方向为分子植物病理学。E-mail：jxl3237@163.com。青枯病病原菌原名为茄假单胞杆菌（Pseudomonas solanacearum E. F. Smith），1995年更改为茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）[1]。烟草青枯病是一种典型的维管束细菌性土传病害，最显著的症状是枯萎。该病害广泛分布于热带、亚热带等50多个国家和地区，在我国南方普遍存在且危害严重，它具有发病快、危害重、损失大等特点，且常与黑胫病和空茎病混合发生[2]，给防治带来了较大的困难。目前，对于烟草青枯病的防治还是以化学防治为主，近几年研究者们筛选出了许多对烟草青枯病有较好抑制效果的药剂，如30.2%芽敌水剂[3]、72%农用硫酸链霉素[4]以及1 B°石硫合剂[5]等药剂。但是化学农药会对环境造成污染，威胁人畜的健康和安全，且随着施用年限和浓度的增加，易导致病原菌产生抗药性。随着烟草青枯病防治研究的不断深入，生物防治已成为防治该病害的研究热点，尤其是通过筛选根围土壤中的拮抗菌与病原菌竞争营养和生存空间的方法，降低病原菌的繁殖率，从而有效控制病害，且对环境无污染，是一种绿色的防治方法。土壤是一切自然环境中细菌的总发源地，在土壤中存在着许多对人类有益的细菌，它们具有分解或者合成的作用，是人类的功臣[6]。可以说，土壤为筛选拮抗细菌防治植物病害提供了很多的细菌资源。且细菌容易分离、繁殖较快，是生物防治的理想菌种。因此，本研究从贵州省天柱县社学乡等发青枯病的烟田土壤中筛选出对青枯病菌具有拮抗作用的细菌并进行鉴定。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株从贵州省麻江县五寨乡烟草种植区中选择发烟草青枯病严重的田块，从中采集病株带回实验室，采用平板划线分离法进行分离、纯化[7]。鉴定为烟草青枯病病原菌后，用蘸根接种法回接[8]，待发病后，再分离和纯化病原菌，并采用灭菌蒸馏水保存方法保存备用[9]。

1.1.2土壤样品从贵州省天柱县社学乡、黄平县白塘村及大方县双山镇的烟草种植地中选择发青枯病的烟田，从中采集健康烟株的根围土壤，共12份。

1.1.3培养基及试剂

1.1.3.1分离和筛选培养基烟草青枯病病原菌和土壤细菌的分离以及对峙培养所采用的培养基均为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）。

1.1.3.2细菌鉴定培养基[10]马铃薯块斜面培养基：将马铃薯洗净去皮，切成长3.5～4.0 cm、宽0.5 cm的楔形薯块斜面。为防止薯块干燥，先在试管底部放1团吸饱水的棉花，再将薯块粗的一端向下放入试管中，塞上棉塞，常规灭菌。为了中和细菌分解淀粉而产生过多的酸，可在灭菌前于薯块斜面上加少量碳酸钙。牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 3～5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 值7.0～7.2。

1.1.3.3细菌鉴定染色剂革兰氏染色剂和芽孢染色剂（孔雀绿染色剂）。

1.2方法

1.2.1病原菌分离选取烟草青枯病病株发病部位的一小块组织（0.5 cm×0.5 cm）制成临时装片，用显微镜观察细菌特有的喷菌现象，再选取被检测发病部位周围的组织，采用平板划线分离法分离[7]。

1.2.2土壤采集选取种植年限较长且青枯病发生较重的烟田，在烟草旺长期采集健康烟株的根围土壤（避免雨季采土）。取样时先除去地面落叶和垃圾，拨开表土约 5 cm 深，剔除石砾和植被残根等杂物，每份样土约30 g（同地区取样点至少相距100 m），装入自封袋并做上记号，带回实验室。

1.2.3土壤细菌分离采用稀释平板法[7]：用1/100天平准确称取土样10 g，放入装有90 mL无菌水的三角瓶中（瓶里放几粒无菌玻璃珠），置于摇床振荡20 min，使微生物细胞分散后，静置20～30 s，即成10-1土样稀释液。用1 mL移液枪吸取10-1土样稀释液1 mL，移入装有9 mL无菌水的试管中，混匀、稀释，即成10-2稀释液，再换1支无菌抢头吸取10-2 稀释液1 mL，移入另支装有9 mL无菌水的试管中，再混匀、稀释，即成10-3 稀释液。依此类推，就会得到不同浓度的悬浮液，分离细菌所需稀释倍数为103、104、105倍。

将培养基平板分别标上稀释度及样品编号，然后用移液枪吸取各样品各稀释度0.1 mL对号分散放于平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。放置20 min后将平板倒置于32 ℃恒温培养箱中培养3～5 d。

1.2.4拮抗细菌筛选方法平板喷雾法[11]：将土壤细菌接在NA平板中央，于32 ℃恒温培养箱中培养。待菌体已在培养基上定殖后（约3 d），用无菌的喉头喷雾器将浓度为 3亿CFU/mL 的烟草青枯菌悬液喷入NA培养基上，静置 20 min 后，将平板倒扣置于32 ℃恒温培养箱培养，24 h后观察并测量抑菌圈的直径。以NA平板上不接菌只喷青枯菌作对照。初筛时做3个重复，挑选出效果较好的生防菌进行复筛，复筛时做5个重复。抑菌圈直径的计算公式为：抑菌圈直径=[（长直径-生防菌直径）+（短直径-生防菌直径）]/2；平均抑菌圈直径=重复的抑菌圈直径之和/重复的次数。

1.2.5拮抗细菌鉴定

1.2.5.116S rDNA序列分析采用CTAB法[12]提取细菌的总DNA，以DNA为模板，以细菌16S rDNA（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）为通用引物[13] [正向PF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，对应于大肠杆菌（Escherichia coli） 8～27 碱基；反向PR：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，对应于大肠杆菌1 492～1 514碱基]，进行16S rDNA片段的扩增。

PCR的反应体系（25.0 μL体系）：10×Buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 μL、dNTPs 2.0 μL、PF 1.2 μL、PR 1.2 μL、DNA模板 2.0 μL、Taq酶 0.25 μL、ddH2O 13.85 μL。

将PCR产物送于北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序，测序完成后，将得到的序列与网站（WWW.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中已知序列进行对比和同源性分析。

1.2.5.2细菌培养特征观察观察单菌落的形态、大小、表面特征以及透明度，斜面细菌菌苔的生长量、生长型以及菌苔与培养基颜色，细菌在NA培养液中生长的混浊状态、沉淀情况以及有无结膜现象，细菌在马铃薯块上生长情况、菌苔形态以及薯块颜色变化情况。

1.2.5.3细菌革兰氏染色和芽孢染色[14]革兰氏染色：镜检时用油镜观察菌体，菌体呈蓝紫色的为革兰氏阳性菌（G+），成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。芽孢染色：将生有芽孢的细菌斜面菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液染10 min，用清水冲洗；用番红液复染30 s，水洗、吸干、镜检。被染后的芽孢呈红色，菌体和芽孢囊呈微红色。

2结果与分析

2.1土壤拮抗细菌筛选结果

从12份土样中共分离细菌65株，经过初筛后，获得20株具有拮抗作用的细菌，其中平均抑菌圈直径小于20 mm的有18株，2株拮抗细菌的平均抑菌圈直径大于20 mm。将这20株具有拮抗作用的细菌进行复筛，发现这20株拮抗细菌均表现出稳定的抑制效果，其中平均抑菌圈直径大于20 mm的2株细菌复筛的平均抑菌圈直径仍然大于20 mm，编号为C3-5、C5-3，其抑菌圈的平均直径分别为39.98、48.88 mm。平板喷雾法对峙效果见图1。

表124 h后2株细菌对烟草青枯菌的抑菌圈直径及形态的影响

拮抗细菌

编号抑菌圈平均

直径（mm）抑菌圈形态C3-539.98半透明、边缘较清晰、界限明显C5-348.88 半透明、边缘较清晰、界限明显CK0无

2.2土壤拮抗细菌鉴定结果

2.2.116S rDNA序列分析结果细菌C3-5的16S rDNA区域基因序列与芽孢杆菌属（Bacillus）中蜡样芽孢杆菌（B. cereus）的同源性达99%。细菌C5-3的16S rDNA区域基因序列与球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）的同源性达99%。

2.2.2细菌培养特征及染色结果表2、表3、图2、图3显示，C3-5的培养特征、染色结果、菌体的形状等特征与蜡样芽孢杆菌的相同，与该菌的16S rDNA序列分析结果一致，因此可鉴定C3-5为蜡样芽孢杆菌。 C5-3的16S rDNA区域表22株细菌培养特征

编号NA上菌落特征斜面菌苔特征液体培养特征（2 d）薯块生长特征（1 d）C3-5菌落大、圆形乳白色、生长良好、扩展状、有絮状沉淀生长良好、易扩散、不透明、粗糙、似蜡样状有小突起、乳白色

无结膜，无气泡菌体乳白色、薯块不变色C5-3菌落大、圆形乳白色、不透明、光滑、有同心圆生长中等、无扩展、乳白色

有絮状沉淀有结膜、无气泡

菌体白色、薯块变褐色

表32株细菌染色特征

编号革兰氏染色芽孢染色C3-5

阳性、杆状、末端方，常成短或长链椭圆形或柱形、中生

C5-3

阳性、杆状至梭状

圆形或卵圆形、中生偏顶生，直径大于菌体

基因序列结果显示与球形赖氨酸芽孢杆菌的同源性高，根文献[15-16]鉴定的结果一致，可以确定该菌属于球形赖氨酸芽孢杆菌。

3结论与讨论

经平板对峙法筛选获得的拮抗细菌占所分离出来的土壤细菌的比例为27.69%。其中，获得了拮抗效果最好的拮抗

细菌2株，分别是蜡样芽孢杆菌和球形赖氨酸芽孢杆菌，且分离于不同的地方。

广泛认可芽孢杆菌属中的多数细菌为良好的拮抗生防菌，如解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巴氏芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和球状芽孢杆菌都有降低植物病害发病率的作用[17]。余建等认为，许多细菌具有生防作用，其中包括芽孢杆菌属，不仅能够防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、烟草青枯病和油菜菌核病，还能促进烟株的生长[18]。易有金等发现，短短芽孢杆菌对烟草青枯病具有较强的拮抗作用，经过室内和田间试验防效都较好[19]。这些结果与本研究相比，证明蜡样芽孢杆菌是一株拮抗效果较好且较稳定的生防菌。

本研究筛选出的另一株拮抗细菌为球形赖氨酸芽孢杆菌。目前，有研究报道可以利用该菌产生的生物锰氧化物吸附和回收金离子[16]以及该菌和嗜冷芽孢八叠球菌（Sporosarcina psychrophila）介导形成白云石晶体[20]，而该菌作为生防菌尚无报道。但是有关于球形芽孢杆菌（B. sphaericus）能作为生防菌的报道。刘波等报道，球形芽孢杆菌对青枯雷尔氏菌的强致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等发现球形芽孢杆菌的发酵上清液对青枯雷尔氏菌具有抑制作用[22]。由此可见，本研究筛选出效果最好的拮抗细菌，且作为与球形芽孢杆菌有关联的细菌球形赖氨酸芽孢杆菌，在防治烟草青枯病上有很大的研究价值。

本研究同时也采用了平板喷雾法筛选拮抗放线菌，其抑菌圈形态比拮抗细菌抑菌圈的规整、透明度高，清晰明显。可能是因为放线菌菌落表面干燥，生长不易受水分的影响，因此当喷青枯菌液在它上面时，不受培养基中水分影响而生长散乱。但是细菌却不同，它喜欢在潮湿的环境下生长，随着水分的流动而生长形成不规则的形态。因此，平板对峙效果也只能证明在室内筛选的结果，要确定真正的生防效果还有待进一步进行田间试验。

参考文献：

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本研究筛选出的另一株拮抗细菌为球形赖氨酸芽孢杆菌。目前，有研究报道可以利用该菌产生的生物锰氧化物吸附和回收金离子[16]以及该菌和嗜冷芽孢八叠球菌（Sporosarcina psychrophila）介导形成白云石晶体[20]，而该菌作为生防菌尚无报道。但是有关于球形芽孢杆菌（B. sphaericus）能作为生防菌的报道。刘波等报道，球形芽孢杆菌对青枯雷尔氏菌的强致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等发现球形芽孢杆菌的发酵上清液对青枯雷尔氏菌具有抑制作用[22]。由此可见，本研究筛选出效果最好的拮抗细菌，且作为与球形芽孢杆菌有关联的细菌球形赖氨酸芽孢杆菌，在防治烟草青枯病上有很大的研究价值。

本研究同时也采用了平板喷雾法筛选拮抗放线菌，其抑菌圈形态比拮抗细菌抑菌圈的规整、透明度高，清晰明显。可能是因为放线菌菌落表面干燥，生长不易受水分的影响，因此当喷青枯菌液在它上面时，不受培养基中水分影响而生长散乱。但是细菌却不同，它喜欢在潮湿的环境下生长，随着水分的流动而生长形成不规则的形态。因此，平板对峙效果也只能证明在室内筛选的结果，要确定真正的生防效果还有待进一步进行田间试验。

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本研究同时也采用了平板喷雾法筛选拮抗放线菌，其抑菌圈形态比拮抗细菌抑菌圈的规整、透明度高，清晰明显。可能是因为放线菌菌落表面干燥，生长不易受水分的影响，因此当喷青枯菌液在它上面时，不受培养基中水分影响而生长散乱。但是细菌却不同，它喜欢在潮湿的环境下生长，随着水分的流动而生长形成不规则的形态。因此，平板对峙效果也只能证明在室内筛选的结果，要确定真正的生防效果还有待进一步进行田间试验。

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