拮抗放线菌06—6的筛选鉴定及其发酵条件优化

郝永丽+宗兆锋+高博+胡海波+曲宝茹

摘要：从采集的土样中分离出拮抗放线菌，并筛选出对4种靶标菌均具有明显拮抗效果的菌株06-6，对该菌株进行发酵条件优化及生理生化鉴定，从而确定该菌株的最佳发酵技术参数，通过鉴定初步将其归类为灰红紫类群（Griseorubroviolaceus）。

关键词：拮抗放线菌；筛选；鉴定；发酵条件；优化

中图分类号： Q939.92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0107-03

收稿日期：2013-09-25

基金项目：教育部创新团队发展计划（编号：200558）；国家高等学校学科创新引智计划（编号：B07049）。

作者简介：郝永丽（1981—），女，内蒙古赤峰人，硕士，助理研究员，从事园艺植物病虫害防治研究。E-mail：yonglihao1981@163.com。拮抗菌作为一种具有丰富资源的微生物类群，其产生的抗生素及其他次生代谢物质在农作物病虫害生物防治方面具有重要作用，是具有使用价值和经济价值的一类微生物，在植物病虫害生物防治中应用前景广[1-4]。利用拮抗放线菌产生的活性物质进行真菌病害防治，具有周期短、易于研究、便于生产、无毒害等优点。本研究旨在从采集的土样中分离筛选杀菌力强、抗菌谱广的拮抗放线菌；并对其发酵条件和分类进行研究，为优势拮抗放线菌在生物防治中的应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土样来源试验用土壤标本分别采集于陕西商洛、周至、乾县、户县及山东诸城。

1.1.2供试病原菌供试靶标菌由西北农林科技大学微生物实验室提供，包括番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、苹果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）和粉红聚端孢（Trichothecium roseum）。

1.2筛选方法

1.2.1菌株的分离与纯化采集的土壤过筛，研磨后称取 0.1 g 样品，制备成不同浓度的稀释液[5]。用移液器吸取特定稀释浓度的液体20 μL，滴在高氏培养基表面，涂匀。将皿倒置于28 ℃培养箱中培养，几天后从皿内分离出单菌落，用显微镜检纯化，保存于G氏斜面中。

1.2.2拮抗放线菌的筛选用打孔器将培养好的放线菌菌苔打成直径5 mm的菌饼置于PDA平板中间，3 d后将同样大小的4种供试病原真菌菌饼对峙接于两侧，21 ℃下培养，观察并测量抑菌圈的大小。将初筛得到的菌株于SNB培养液中振动培养，发酵液离心后取上清液，采用微孔扩散法测定发酵液及发酵滤液的抑菌活性，供试靶标菌为西瓜枯萎菌。

1.3拮抗菌的形态和生理生化鉴定

将待鉴定的菌株作插片培养，观察记载其生长情况、基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的颜色、形态及是否产生可溶性色素[6]。菌株生理生化鉴定参照文献[7]，包括淀粉水解、H2S产生、黑色素产生、碳源利用、纤维素水解、牛奶凝固和液化等[8]。

1.4拮抗菌株发酵条件优化

1.4.1培养基的筛选将菌株06-6分别接种于13种液体发酵培养基（具体成分见表1）中，28 ℃下摇床培养6 d，将发酵液离心，取其上清液备用。选择西瓜枯萎菌为靶标菌，在准备好的PDA平板上均匀涂好靶标菌。将3张9 mm2大小的滤纸片均匀铺于PDA平板上，每张小纸片滴入10 μL的发酵上清液。3 d后测量数据，用抑菌圈直径表示不同培养基培养条件下的菌株06-6对病原菌拮抗作用的强弱。1.4.2最适装液量pH值自然，分别在250 mL三角瓶中加入DBY液体培养基25、50、75、100、125、150 mL。灭菌后接种菌株06-6，置摇床发酵培养6 d后，将各发酵上清液分别加入到准备好的PDA平板中央[9]。5 d后测量抑菌作用。

1.4.3最佳发酵时间pH值自然，250 mL三角瓶中接种 06-6 菌悬液，置摇床培养，分别于4、5、6、7、8、9 d时测量抑菌作用，确定最宜发酵时间。

1.4.4发酵初始pH值利用选择好的瓶装量和培养时间，将初始pH值分别调至6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。测量抑菌作用。

2结果与分析

2.1拮抗菌株的分离和筛选

利用稀释分离法，从采集的土样中分离放线菌。结果表明，在分离出的放线菌中对4种病原真菌有很强抑制作用的菌株有4株，其中菌株06-6无论在皿内拮抗试验还是在发酵液抑菌作用测定方面都表现出极强的抑菌效果。

2.2拮抗菌06-6的形态和生理生化特征

2.2.1形态特征菌株06-6在高氏一号培养基中，气生菌丝直，呈灰色；基内菌丝培养初期为白色，到孢子成熟以后转

表2菌株06-6的代谢产物对病原菌的抑制作用

处理抑菌圈直径（cm）灰葡萄孢西瓜枯萎菌粉红聚端孢苹果炭疽菌菌饼29.510.0 29.5 27.0 发酵液22.3 21.7 24.5 19.8

为橙黄色；孢子椭圆形，表面光滑，串生；孢子丝不结球。

2.2.2菌株06-6的生理生化特性菌株06-6可使牛奶钝化，明胶不液化，淀粉水解；纤维素中能生长，但是不利用；不产生硫化氢。该菌可利用蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、肌糖、山梨糖、半乳糖、阿拉伯糖；不能利用木糖。

2.3拮抗菌发酵条件优化

2.3.1不同培养基对菌株抑菌活性的影响从图1可以看出，菌株06-6在DBY、SNB、aSNB培养基中的发酵液抑菌率较高，其中对西瓜枯萎菌抑制效果最好是在DBY中培养的菌株发酵液，抑菌圈直径达 23 mm。确定DBY为最佳培养基，配方为葡萄糖4.0 g、大豆粉0.5 g、酵母粉0.5 g、硫酸铵 0.5 g、NaCl 0.1 g、K2HPO4 0005 g。

2.3.2几个发酵参数对发酵液抑菌作用的影响本试验在

以DBY为基础培养基条件下，确定了菌株06-6的最适宜发酵参数，即发酵初始pH值7.5、瓶装量50 mL、培养时间 6 d、摇床转速150 r/min

3结论与讨论

3.1拮抗菌株的分离筛选

围绕如何改进和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本试验从采集的土样中，通过皿内拮抗试验筛选出4株代表菌株，进一步筛选后得到优秀菌株06-6。皿内检测作为筛选有效生防菌的重要指标，具有简便快捷的特点，可以在短时间内对多数菌株进行筛选。试验所采用的供试靶标菌有限，可能会漏选一些对供试靶标菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6发酵参数研究

放线菌的发酵是一个复杂过程，受诸多条件的影响。除受培养基成分影响外，还受培养时间、初始pH值、温度、通气量等因素的影响[10]。因此，必须研究生产菌种的最佳发酵技术参数，设计合理的发酵工艺，使生产菌种处于最佳发酵条件下，为其进行发酵罐培养和生物农药的开发提供理论依据。

2.3菌株06-6的形态观察和生理生化鉴定

本试验通过对菌株06-6的形态观察和生理生化鉴定，将菌株初步归类为灰红紫类群（Griseorubroviolaceus）。近年来，放线菌的分类一般是化学分类和分子分类等几种分类依据的结合，而不再是单纯地形态分类和化学分类。对新分离的菌株，单靠一种分类方法是不可靠的，需要传统的经典分类、数值分类、化学分类、分子分类等几种信息的综合[11]。因此，该菌株的分类还有待于用分子鉴定等其他方法进行验证。

参考文献：

[1]徐剑宏，王建伟，胡晓丹，等. 小麦赤霉病菌拮抗菌AF0907的分离鉴定及其拮抗特性[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：517-522.

[2]刘永锋，陆凡，陈志谊，等. 拮抗细菌T429和T392的生物活性及其对水稻白叶枯病的防治效果[J]. 江苏农业学报，2012，28（4）：733-737.

[3]周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986.

[4]郭风柳，张海颖，李勇，等. 马铃薯疮痂病拮抗菌株B1的鉴定及防效测定[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：90-93.

[5]安德荣，慕小倩，刘翠娟，等. 土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]. 微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 农用抗生素和抗生菌的筛选[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975：11-12.

[8]徐长伦，董平，吾提库尔·马合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素产生菌的鉴定[J]. 微生物学通报，1994，21（6）：350-352.

[9]庄敬华，高增贵，刘限，等. 不同发酵条件对木霉产孢类型的影响[J]. 中国生物防治，2005（1）：37-40.

[10]刘翠娟，段琦梅，安德荣. 抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化[J]. 微生物学杂志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.

2.3.2几个发酵参数对发酵液抑菌作用的影响本试验在

以DBY为基础培养基条件下，确定了菌株06-6的最适宜发酵参数，即发酵初始pH值7.5、瓶装量50 mL、培养时间 6 d、摇床转速150 r/min

3结论与讨论

3.1拮抗菌株的分离筛选

围绕如何改进和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本试验从采集的土样中，通过皿内拮抗试验筛选出4株代表菌株，进一步筛选后得到优秀菌株06-6。皿内检测作为筛选有效生防菌的重要指标，具有简便快捷的特点，可以在短时间内对多数菌株进行筛选。试验所采用的供试靶标菌有限，可能会漏选一些对供试靶标菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6发酵参数研究

放线菌的发酵是一个复杂过程，受诸多条件的影响。除受培养基成分影响外，还受培养时间、初始pH值、温度、通气量等因素的影响[10]。因此，必须研究生产菌种的最佳发酵技术参数，设计合理的发酵工艺，使生产菌种处于最佳发酵条件下，为其进行发酵罐培养和生物农药的开发提供理论依据。

2.3菌株06-6的形态观察和生理生化鉴定

本试验通过对菌株06-6的形态观察和生理生化鉴定，将菌株初步归类为灰红紫类群（Griseorubroviolaceus）。近年来，放线菌的分类一般是化学分类和分子分类等几种分类依据的结合，而不再是单纯地形态分类和化学分类。对新分离的菌株，单靠一种分类方法是不可靠的，需要传统的经典分类、数值分类、化学分类、分子分类等几种信息的综合[11]。因此，该菌株的分类还有待于用分子鉴定等其他方法进行验证。

参考文献：

[1]徐剑宏，王建伟，胡晓丹，等. 小麦赤霉病菌拮抗菌AF0907的分离鉴定及其拮抗特性[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：517-522.

[2]刘永锋，陆凡，陈志谊，等. 拮抗细菌T429和T392的生物活性及其对水稻白叶枯病的防治效果[J]. 江苏农业学报，2012，28（4）：733-737.

[3]周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986.

[4]郭风柳，张海颖，李勇，等. 马铃薯疮痂病拮抗菌株B1的鉴定及防效测定[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：90-93.

[5]安德荣，慕小倩，刘翠娟，等. 土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]. 微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 农用抗生素和抗生菌的筛选[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975：11-12.

[8]徐长伦，董平，吾提库尔·马合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素产生菌的鉴定[J]. 微生物学通报，1994，21（6）：350-352.

[9]庄敬华，高增贵，刘限，等. 不同发酵条件对木霉产孢类型的影响[J]. 中国生物防治，2005（1）：37-40.

[10]刘翠娟，段琦梅，安德荣. 抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化[J]. 微生物学杂志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.

2.3.2几个发酵参数对发酵液抑菌作用的影响本试验在

以DBY为基础培养基条件下，确定了菌株06-6的最适宜发酵参数，即发酵初始pH值7.5、瓶装量50 mL、培养时间 6 d、摇床转速150 r/min

3结论与讨论

3.1拮抗菌株的分离筛选

围绕如何改进和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本试验从采集的土样中，通过皿内拮抗试验筛选出4株代表菌株，进一步筛选后得到优秀菌株06-6。皿内检测作为筛选有效生防菌的重要指标，具有简便快捷的特点，可以在短时间内对多数菌株进行筛选。试验所采用的供试靶标菌有限，可能会漏选一些对供试靶标菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6发酵参数研究

放线菌的发酵是一个复杂过程，受诸多条件的影响。除受培养基成分影响外，还受培养时间、初始pH值、温度、通气量等因素的影响[10]。因此，必须研究生产菌种的最佳发酵技术参数，设计合理的发酵工艺，使生产菌种处于最佳发酵条件下，为其进行发酵罐培养和生物农药的开发提供理论依据。

2.3菌株06-6的形态观察和生理生化鉴定

本试验通过对菌株06-6的形态观察和生理生化鉴定，将菌株初步归类为灰红紫类群（Griseorubroviolaceus）。近年来，放线菌的分类一般是化学分类和分子分类等几种分类依据的结合，而不再是单纯地形态分类和化学分类。对新分离的菌株，单靠一种分类方法是不可靠的，需要传统的经典分类、数值分类、化学分类、分子分类等几种信息的综合[11]。因此，该菌株的分类还有待于用分子鉴定等其他方法进行验证。

参考文献：

[1]徐剑宏，王建伟，胡晓丹，等. 小麦赤霉病菌拮抗菌AF0907的分离鉴定及其拮抗特性[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：517-522.

[2]刘永锋，陆凡，陈志谊，等. 拮抗细菌T429和T392的生物活性及其对水稻白叶枯病的防治效果[J]. 江苏农业学报，2012，28（4）：733-737.

[3]周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986.

[4]郭风柳，张海颖，李勇，等. 马铃薯疮痂病拮抗菌株B1的鉴定及防效测定[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：90-93.

[5]安德荣，慕小倩，刘翠娟，等. 土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]. 微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 农用抗生素和抗生菌的筛选[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975：11-12.

[8]徐长伦，董平，吾提库尔·马合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素产生菌的鉴定[J]. 微生物学通报，1994，21（6）：350-352.

[9]庄敬华，高增贵，刘限，等. 不同发酵条件对木霉产孢类型的影响[J]. 中国生物防治，2005（1）：37-40.

[10]刘翠娟，段琦梅，安德荣. 抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化[J]. 微生物学杂志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.