2种蝴蝶兰组织培养快繁技术

2014-08-12宋微潘静霞吴静

江苏农业科学 2014年6期

宋微+潘静霞+吴静

摘要：以红龙、皇帝2个品种的蝴蝶兰花梗为材料，1/3MS培养基为基本培养基，筛选花梗使用HgCl2消毒的最佳时间，增殖培养基的最佳激素、蔗糖浓度，以确立最佳培养配方。结果表明，红龙、皇帝品种最佳的诱导材料为开过花的花梗；红龙品种的最佳消毒时间为20 min，皇帝品种的最佳消毒时间为18 min；适合红龙品种生长的最佳激素组合为5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，蔗糖浓度为25 g/L；适合皇帝品种生长的最佳激素组合为5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，蔗糖浓度为20 g/L。

关键词：蝴蝶兰；组织培养；消毒时间；激素

中图分类号： Q943.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0055-02

收稿日期：2013-09-02

基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK2011498、BK2010345）；江苏农林职业技术学院课题。

作者简介：宋微（1978—），女，黑龙江大庆人，博士，副教授，从事植物组织培养、微生物和植物病理学研究。E-mail：13360790@qq.com。蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）系兰科蝴蝶兰属植物，花大而美丽，花期长，品种多，栽培广泛，深受人们喜爱，在花卉市场上常常供不应求。在自然条件下，蝴蝶兰主要靠分株、种子繁殖，繁殖率低，而且由于长期进行有性繁殖，带病毒株增多，逐渐使种性降低，影响生长。如今组织培养已经成为蝴蝶兰无性繁殖最常用的方法，既可以保持母本的优良性状，快速繁殖子代，又可以反季节栽培适应市场需求[1-4]。以花梗芽作为外植体进行培养是代替蝴蝶兰茎尖培养的一种方法[1]，在不影响蝴蝶兰母株的优良性状和经济条件下选取外植体，提高花梗芽的诱导率，避免病毒扩散和危害，保持母株优良的生物学特性[2]。本研究以花梗芽为外植体，筛选最佳快繁培养基，研究红龙（Phalaenopsis amabilis “Red Dragon”）、皇帝（Phalaenopsis amabilis “Emperor”）2个品种的最佳培养方案，为这2个品种的快速繁育提供必要的技术支持。

1材料与方法

1.1材料

分别取蝴蝶兰红龙、皇帝2个品种开过花的花梗，除基部外至顶端第6节至第7节剥开可见到芽的部位为组织培养的外植体材料，每个样本100个，重复3次。

1.2方法

1.2.1清洗与消毒从温室里取出材料后用流水冲洗1 h，加入3%的洗衣粉，取生长时间超过40 d的花梗，提前把苞叶剥去后用于接种[5-7]。以75%乙醇棉球擦拭花梗表面，放在无菌操作台上备用，以节为单位切成段，每节段上端留2 cm，下端留3 cm。以解剖刀除去花梗节芽上的苞叶，去除节段表面病斑、焦枯部分[2]。以75%乙醇棉球重复擦拭去苞叶的花梗芽，力度适中，防止伤芽。以75%乙醇振荡浸泡30 s，而后以0.1% HgCl2消毒，消毒时间分别采用8、10、12、14、16、18、20 min，再以无菌水振荡冲洗3次，用解剖刀切去消毒后花梗两端各0.5 cm，以芽自然生长方向正向插入培养基内[8]。

1.2.2培养基基本培养基为1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂+20g/L蔗糖；增殖培养基为1/3MS+7 g/L琼脂+1、2、3、4、5 mg/L 6-BA+0.1、0.2、03、0.4、0.5 mg/L NAA+5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖，pH值为6.8。组培瓶内培养基为100 mL/瓶，分装后于121 ℃下灭菌21 min，备用。恒温26 ℃培养，光照时间为10～12 h/d，光照强度为1 600～2 000 lx。

1.3数据处理

试验所得的数据采用SPSS 11.0软件统计分析。

2个品种蝴蝶兰以0.1%HgCl2消毒8 min的外植体污染率均最高，分别为76.7%、93.3%。随着消毒时间的延长，外植体污染率降低，当消毒时间延长至20 min时，红龙污染率为16.6%，皇帝污染率为16.7%，但芽同时出现毒死现象，芽死亡率为6.7%，致使萌芽率降低，所以不同品种的消毒时间存在着差异。由此可见，红龙的最佳消毒时间为20 min，皇帝的最佳消毒时间为18 min，此消毒时间根据花梗芽的饱满成熟度有所不同。

表1不同消毒时间对红龙和皇帝2个品种萌发的影响

灭菌时间

（min）污染率（%）死亡率（%）萌发率（%）红龙皇帝红龙皇帝红龙皇帝876.693.30010.0 3.3 1073.383.30020.010.0 1263.380.00043.316.6 1450.056.60040.0 40.01643.346.60050.056.6 1826.620.00070.083.3 2016.616.70 6.7 86.6 66.6 注：培养基为1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂+20 g/L 蔗糖。

2.2不同浓度的外源激素对花梗诱导和丛生芽产生的影响

经过40 d培养后，由表2可知，当激素组合为1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA时，红龙、皇帝平均芽长为1.56、1.92 cm，且其平均芽长随着6-BA、NAA浓度的增加而变长。当激素组合为5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA时，红花、皇帝丛生芽的平均长度达到最长，为3.04、2.67 cm。说明红龙和皇帝组培的最佳激素组合均为5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

不同激素组合对2个品种丛生芽诱导的影响

激素浓度（mg/L）诱导率（%）平均芽长（cm）6-BANAA红龙皇帝红龙皇帝10.120.0a95.6a1.56a1.92a20.240.0b96.6a1.65a1.98a30.360.0b97.2a2.41b2.49b40.470.0c97.2a2.42b2.58b50.576.6d100.0b3.04c2.67c注：同列数据后不同字母表示差异显著（P<0.05）。

2.3不同蔗糖浓度对芽长和丛生芽的影响

在植物组织培养中，尤其是在蝴蝶兰快繁中，主要把蔗糖作为碳源，不同的蔗糖浓度对丛生芽的产生和芽长有很大的差异[9]。本试验对红龙和皇帝2个品种分别用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖进行处理，结果见表3。从表3可看出，当蔗糖浓度为25 g/L时，红龙品种的平均芽长最长，为3.0 cm，丛生芽平均个数为1.3个。当蔗糖浓度为20 g/L时，皇帝的平均芽长最长，为2.9 cm，丛生芽平均个数为2.3个。说明适合蝴蝶兰红龙、皇帝品种的最佳蔗糖浓度分别为25、20 g/L。

不同蔗糖浓度对丛生芽生长的影响

蔗糖浓度

（g/L）红龙皇帝诱导率

（%）平均芽长

（cm）丛生芽

平均个数诱导率

（%）平均芽长

（cm）丛生芽

平均个数5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3结论

许多研究结果表明，花梗是蝴蝶兰组织培养的最佳外植体，植物生长激素浓度、蔗糖浓度等都是影响休眠芽萌发的关键因素[4，8，10]。笔者发现，蔗糖浓度会直接影响蝴蝶兰不同品种的增殖率，不同品种的外植体也要进行不同时间的消毒，否则会提高污染率或毒杀芽体。

综上所述，红龙的最佳消毒时间为20 min，皇帝最佳的消毒时间是18 min，适合蝴蝶兰红龙组培快繁的最佳培养基为1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂+25 g/L蔗糖，适合蝴蝶兰皇帝组培快繁的最佳培养基为1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 琼脂+20 g/L蔗糖。

参考文献：

[1]刘翠兰，王小芳，李双云，等. 蝴蝶兰花梗芽的组织培养[J]. 山东林业科技，2004（4）：37.

[2]张伟，曾伏虎，张苏锋. 蝴蝶兰的组织培养与快速繁殖[J]. 信阳师范学院学报：自然科学版，2004，17（3）：335-337.

[3]林汉锐，钟融融，洪生标，等. 蝴蝶兰新品种满天红的特征特性及栽培技术[J]. 广东农业科学，2003（2）：11-12.

[4]胡松华. 蝴蝶兰[M]. 广州：广东科学技术出版社，2001.

[5]潘学峰，王安石，李海珠. 蝴蝶兰组培快繁技术的研究进展[J]. 热带林业，2005，33（1）：45-47.

[6]周俊彦，郭扶兴. 细胞分裂素类物质在植物体细胞胚发生中的作用[J]. 植物生理学通讯，1996，32（4）：247-253.

[7]李进进，廖俊杰，柯丽婉，等. 蝴蝶兰根段的组织培养[J]. 植物生理学通讯，2000，36（1）：37.

[8]鲁雪华，郭文杰，徐立晖，等. 蝴蝶兰花梗节间段培养繁殖的初步研究[J]. 园艺学报，2002，29（5）：491-492.

[9]王蒂. 植物组织培养[M]. 北京：中国农业出版社，2004.

[10]李浚明，编译. 植物组织培养教程[M]

2.3不同蔗糖浓度对芽长和丛生芽的影响