长白山区人参根际土壤微生物多样性分析

杨阳+金东淳+于小梅+唐丽娜

摘要：用PCR-DGGE方法，分析长白山区人参根际土壤微生物的群落结构及多样性。以三年生、五年生的人参根际土壤及无参地土壤为材料，对PCR反应条件、DGGE中凝胶单体、变性剂浓度进行了优化，并对真菌3套引物进行了对比分析，得出细菌16S rDNA V3区引物314F-GC/518R、8%凝胶单体、60%～40%变性剂DGGE分离效果较好；真菌ITS区引物，12%凝胶单体、60%变性剂，6%凝胶单体、40%变性剂搭配效果最佳。用该反应体系扩增出来的PCR产物，在DGGE凝胶上能够清晰地分辨出人参根际土壤细菌和真菌的多样性，由此分析出细菌、真菌的群落结构都存在明显差异。此方法简便快捷，为进一步研究人参根际土壤微生物奠定了基础。

关键词：人参（Panax ginseng C. A. Meyer）；根际土壤微生物；PCR-DGGE；体系优化；多样性

中图分类号： Q938文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0052-03

收稿日期：2014-01-16

基金项目：韩国农村振兴厅国际合作项目（编号：41309001）。

作者简介：杨阳（1989—），女，吉林辽源人，硕士研究生，从事微生物分子生物学研究。E-mail：yangyangopq@sina.com。

通信作者：金东淳，副教授。Tel：（0433）2435559；E-mail：jdc1200@ybu.edu.cn。微生物与植物的生长存在着密切的联系，其群落的变化直接影响植物病害发生与否，所以对微生物进行深入研究尤为必要[1]。由于自然界中绝大多数微生物不可以进行纯培养，传统纯培养法就存在着局限性，造成大量微生物信息丢失[2]。而基于变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将不同微生物的DNA分开，具有直观、快速和不依赖于细菌培养的优点，已广泛应用于微生物群落的多样性分析[3-7]。人参（Panax ginseng C. A. Meyer）为五加科人参属多年生宿根双子叶植物，被人们称为“百草之王”，是闻名遐迩的“东北三宝”之一，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材[8]。由于人参属于忌连作作物，存在着连作障碍，栽过一茬人参的土壤继续种植人参后，人参产量急剧下降，一般要等到20～30年后才能继续种植人参。采用伐林栽参，违背了可持续发展的原则，因此，为克服连作障碍，对人参根际土壤微生物的研究备受关注。本研究采用PCR-DGGE方法，旨在建立人参根际土壤微生物16S、18S rDNA文库，探究人参根际土壤微生物的多样性，构建根际微生物种类信息，从微生物角度阐明人参连作障碍机理。

1材料与方法

1.1材料

土壤样品（1号、2号为三年生有参地，3号为三年生无参地，4号、5号为五年生有参地，6号为五年生无参地）于2013年9月1日在吉林省延边朝鲜族自治州安图县新合乡青沟子村人参种植基地采集，共6个样品，放入无菌袋中置-80 ℃冰箱中保存。

1.2主要仪器

WD-9402A基因扩增仪（北京市六一仪器厂）；DGGE-1B型变性梯度凝胶电泳系统（南京新校园生物技术研究所）；凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）。

1.3主要试剂

土壤微生物DNA提取试剂盒（the Power Soil DNA extraction kit，美国加利福尼亚州Mobio公司）；引物（生工生物工程上海有限公司）；TaKaRa Taq（Code No.R001B，宝生物工程大连有限公司）。

1.4方法

1.4.1土壤微生物总DNA提取取土样去除杂质，充分研磨后称取0.25 g，用the Power Soil DNA extraction kit试剂盒，按照说明书的步骤进行DNA提取后，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，与DNA Maker作对照，将各样品DNA浓度调到 20 ng/μL 左右，于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2PCR反应体系优化在25 μL PCR反应体系中，固定2.5 μL 10×Buffer和0.4 μL Taq（5 U/μL）的加入量，按照单因素试验方法检测其他因素对PCR的影响。各变量设计5个梯度（表1）。引物314F-GC/518R，扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃最后延伸6 min[9]。

表1PCR反应体系优化设计

编号DNA

（ng）dNTPs

（mmol/L）Mg2+

（mmol/L）引物

（μmol）17.50.050.51.2222.50.201.52.4337.50.352.53.6452.50.503.54.8567.50.654.56.0

1.4.3PCR-DGGE反应体系优化扩增细菌16S V3区的引物和程序与“1.4.2”节相同，经一次PCR 50 μL反应体系。DGGE用8%（m/V）的凝胶单体，变性剂范围40%～60%，反应条件为：温度60 ℃，A阶段电压60 V，1 h；B阶段电压 100 V，15 h。扩增真菌分别用特异性引物FF390/FR1-GC；ITS1/ITS4、ITS1-GC/ITS2；NS1/EF3、NS1/FR1-GC。（1）引物FF390/FR1-GC，经一次PCR 50 μL反应体系，扩增程序：95 ℃预变性8 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火45s，72 ℃延伸 2 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。（2）引物ITS1/ITS4、ITS1-GC/ITS2用嵌套式PCR（巢式PCR），第一次PCR 25 μL反应体系，扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后 72 ℃ 延伸10 min；第二次PCR 50 μL反应体系，扩增程序不变。（3）引物NS1/EF3、NS1/FR1-GC用嵌套式PCR，第一次PCR 25 μL反应体系，扩增程序：94 ℃预变性8 min；94 ℃ 变性30 s，47 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共35个循环；最后72 ℃延伸 10 min；第二次PCR 50 μL反应体系，变化退火温度48 ℃ 45 s。首先，真菌3套引物DGGE均用b条件：12%凝胶单体、60%变性剂，6%凝胶单体、40%变性剂，反应条件为：温度60 ℃，A阶段电压60 V、1 h，B阶段电压 120 V、26 h。电泳完毕，将胶板于含有EB的缓冲液中染色30 min，将染色后的凝胶置凝胶成像仪中拍摄并分析。另外，真菌ITS区引物DGGE用a条件：8%（m/V）的凝胶单体，变性剂范围40%～60%，反应条件为：温度60 ℃，A阶段电压60 V、1 h，B阶段电压120 V、26 h。

2结果与分析

2.1土壤微生物总DNA提取效果检测

土壤微生物总DNA的提取效果直接影响后续试验，本试验用the Power Soil DNA extraction kit试剂盒，琼脂糖凝胶检测结果如图1，条带清晰。

2.2PCR反应体系优化

影响PCR扩增效果的因素有多种，但DNA、dNTPs、Mg2+、引物的浓度在PCR反应体系中的影响尤为重大。为

此，本试验中采用单因素试验对其适宜的浓度进行了优化。（1）DNA浓度太低会降低分子碰撞的概率，扩增产物不稳定；浓度太高会增加非专一扩增产物或出现弥散性条带[10]。（2）dNTPs是PCR反应的原料，浓度太低会过早消耗，无法继续合成DNA，浓度太高会导致非特异性扩增[11]。（3）Mg2+的主要作用是提高Taq酶的活性，适量的浓度会提高PCR的扩增效率，浓度过低会降低Taq酶的活性，扩增产物少甚至扩不出来，浓度太高会形成金属螯合物，不利于PCR的进行[12]。（4）引物浓度太低扩增产物太少，太高会导致非特异性扩增或引物之间形成二聚体[13-14]。

2.3PCR-DGGE反应体系优化

要获得区分不同样品的最大分辨率的DGGE图谱，合理的凝胶梯度、变性剂梯度及电泳时间十分重要。利用合理的

3讨论与结论

PCR-DGGE反应涉及诸多因素，每个因素的反应参数对整个体系的稳定性和重复性都有影响，确定合适的反应参数是确保土壤微生物分析准确的前提。本试验采用单因素变化设计，对各主要影响因素（模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度）进行优化，得到人参根际土壤微生物PCR-DGGE反应体系优化结果：25反应体系中DNA浓度52.5 ng、dNTPs浓度0.20 mmol/L、Mg2+浓度1.50 mmol/L、引物浓度4.8 μmol搭配效果最佳。

本试验中细菌DGGE图谱可以看出每个样品均可分离出较多的条带，其中不同的条带代表不同细菌的基因片段，说明每个样品都存在着丰富的细菌种类，并且每个样品的分离条带差异不明显。真菌DGGE图谱可以看出根际真菌与非根际真菌种类存在明显差异，并且真菌种类随着种植年限的增加而变少。人参的种植年限越高，其根际优势种群越少，病害越易发生，所以，真菌群落的动态变化与病害的发生存在着直接的关系。

DGGE指纹图谱能够直观地反映根际微生物的变化，它是一种能够提供微生物群落结构变化的研究方法，为了进一步分析其多样性，还需要对DGGE条带进行切胶回收、克隆测序，后续试验正在进行当中。另外，利用基因组学、蛋白质组学等方法，对木霉菌、病原菌、人参三方的互作关系进行进一步研究，了解群落中占优势种群、病原菌种群的变化趋势，研制木霉菌新的生物制剂，会对人参病害的发生起到一定的预防作用，以期为克服人参连作障碍取得突破性进展。

参考文献：

[1]王萌，严铸云，何冬梅，等. 川芎内生真菌PCR-DGGE分析条件的建立和优化[J]. 华西药学杂志，2013，28（4）：335-337.

[2]Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

[3]Ceteciolgu Z，Ince B K，Kolukirik M，et al. Biogeographical distribution and diversity of bacterial and archaeal communities within highly polluted anoxic marine sediments from the Marmara Sea[J]. Marine Pollution Bulletin，2009，58（3）：384-395.

[4]Ning J，Liebich J，Kstner M，et al. Different influences of DNA purity indices and quantity on PCR-based DGGE and functional gene microarray in soil microbial community study[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，82（5）：983-993.

[5]Hovda M B，Lunestad B T，Fontanillas R，et al. Molecular characterisation of the intestinal microbiota of farmed Atlantic salmon（Salmo salar L.）[J]. Aquaculture，2007，272（1/2/3/4）：581-588.

[6]刘慧杰，杨彩云，田蕴，等. 基于PCR-DGGE技术的红树林区微生物群落结构[J]. 微生物学报，2010，50（7）：923-930.

[7]高崇洋，赵阳国，王爱杰，等. 耕作和施肥对不同深度黑土中细菌群落结构的影响[J]. 微生物学报，2010，50（1）：67-75.

[8]张国荣，庞立杰，董宇. 关于人参栽培可持续发展的思考[J]. 人参研究，2007，19（4）：42-43.

[9]Huang X，Tian Y，Luo Y R，et al. Modified sublimation to isolate phenanthrene-degrading bacteria of the genera Sphingomonas and Burkholderia from Xiamen oil port[J]. Marine Pollution Bulletin，2008，57（6/12）：538-543.

[10]杨华，宋绪忠，尹光天，等. 黄藤ISSR反应体系的条件优化[J]. 福建林学院学报，2006，26（2）：152-155.

[11]Joshi S P，Gupta V S，Aggarwal R K，et al. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat（ISSR） polymorphism in the genus Oryza[J]. Theoretical and Applied Genetics，2000，100（8）：1311-1320.

[12]林万明，林万明. PCR技术操作和应用指南[M]. 北京：人民军医出版社，1993：7-14.

[13]李海生，陈桂珠. 红树植物海桑简单重复序列区间（ISSR）条件的优化[J]. 广东教育学院学报，2004，24（2）：80-83.

[14]Watanabe K，Kodama Y，Harayama S. Design and evaluation of PCR primers to amplify bacterial 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting[J]. Journal of Microbiological Methods，2001，44（3）：

2结果与分析

2.1土壤微生物总DNA提取效果检测

土壤微生物总DNA的提取效果直接影响后续试验，本试验用the Power Soil DNA extraction kit试剂盒，琼脂糖凝胶检测结果如图1，条带清晰。

2.2PCR反应体系优化

影响PCR扩增效果的因素有多种，但DNA、dNTPs、Mg2+、引物的浓度在PCR反应体系中的影响尤为重大。为

此，本试验中采用单因素试验对其适宜的浓度进行了优化。（1）DNA浓度太低会降低分子碰撞的概率，扩增产物不稳定；浓度太高会增加非专一扩增产物或出现弥散性条带[10]。（2）dNTPs是PCR反应的原料，浓度太低会过早消耗，无法继续合成DNA，浓度太高会导致非特异性扩增[11]。（3）Mg2+的主要作用是提高Taq酶的活性，适量的浓度会提高PCR的扩增效率，浓度过低会降低Taq酶的活性，扩增产物少甚至扩不出来，浓度太高会形成金属螯合物，不利于PCR的进行[12]。（4）引物浓度太低扩增产物太少，太高会导致非特异性扩增或引物之间形成二聚体[13-14]。

2.3PCR-DGGE反应体系优化

要获得区分不同样品的最大分辨率的DGGE图谱，合理的凝胶梯度、变性剂梯度及电泳时间十分重要。利用合理的

3讨论与结论

PCR-DGGE反应涉及诸多因素，每个因素的反应参数对整个体系的稳定性和重复性都有影响，确定合适的反应参数是确保土壤微生物分析准确的前提。本试验采用单因素变化设计，对各主要影响因素（模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度）进行优化，得到人参根际土壤微生物PCR-DGGE反应体系优化结果：25反应体系中DNA浓度52.5 ng、dNTPs浓度0.20 mmol/L、Mg2+浓度1.50 mmol/L、引物浓度4.8 μmol搭配效果最佳。

本试验中细菌DGGE图谱可以看出每个样品均可分离出较多的条带，其中不同的条带代表不同细菌的基因片段，说明每个样品都存在着丰富的细菌种类，并且每个样品的分离条带差异不明显。真菌DGGE图谱可以看出根际真菌与非根际真菌种类存在明显差异，并且真菌种类随着种植年限的增加而变少。人参的种植年限越高，其根际优势种群越少，病害越易发生，所以，真菌群落的动态变化与病害的发生存在着直接的关系。

DGGE指纹图谱能够直观地反映根际微生物的变化，它是一种能够提供微生物群落结构变化的研究方法，为了进一步分析其多样性，还需要对DGGE条带进行切胶回收、克隆测序，后续试验正在进行当中。另外，利用基因组学、蛋白质组学等方法，对木霉菌、病原菌、人参三方的互作关系进行进一步研究，了解群落中占优势种群、病原菌种群的变化趋势，研制木霉菌新的生物制剂，会对人参病害的发生起到一定的预防作用，以期为克服人参连作障碍取得突破性进展。

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2结果与分析

2.1土壤微生物总DNA提取效果检测

土壤微生物总DNA的提取效果直接影响后续试验，本试验用the Power Soil DNA extraction kit试剂盒，琼脂糖凝胶检测结果如图1，条带清晰。

2.2PCR反应体系优化

影响PCR扩增效果的因素有多种，但DNA、dNTPs、Mg2+、引物的浓度在PCR反应体系中的影响尤为重大。为

此，本试验中采用单因素试验对其适宜的浓度进行了优化。（1）DNA浓度太低会降低分子碰撞的概率，扩增产物不稳定；浓度太高会增加非专一扩增产物或出现弥散性条带[10]。（2）dNTPs是PCR反应的原料，浓度太低会过早消耗，无法继续合成DNA，浓度太高会导致非特异性扩增[11]。（3）Mg2+的主要作用是提高Taq酶的活性，适量的浓度会提高PCR的扩增效率，浓度过低会降低Taq酶的活性，扩增产物少甚至扩不出来，浓度太高会形成金属螯合物，不利于PCR的进行[12]。（4）引物浓度太低扩增产物太少，太高会导致非特异性扩增或引物之间形成二聚体[13-14]。

2.3PCR-DGGE反应体系优化

要获得区分不同样品的最大分辨率的DGGE图谱，合理的凝胶梯度、变性剂梯度及电泳时间十分重要。利用合理的

3讨论与结论

PCR-DGGE反应涉及诸多因素，每个因素的反应参数对整个体系的稳定性和重复性都有影响，确定合适的反应参数是确保土壤微生物分析准确的前提。本试验采用单因素变化设计，对各主要影响因素（模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度）进行优化，得到人参根际土壤微生物PCR-DGGE反应体系优化结果：25反应体系中DNA浓度52.5 ng、dNTPs浓度0.20 mmol/L、Mg2+浓度1.50 mmol/L、引物浓度4.8 μmol搭配效果最佳。

本试验中细菌DGGE图谱可以看出每个样品均可分离出较多的条带，其中不同的条带代表不同细菌的基因片段，说明每个样品都存在着丰富的细菌种类，并且每个样品的分离条带差异不明显。真菌DGGE图谱可以看出根际真菌与非根际真菌种类存在明显差异，并且真菌种类随着种植年限的增加而变少。人参的种植年限越高，其根际优势种群越少，病害越易发生，所以，真菌群落的动态变化与病害的发生存在着直接的关系。

DGGE指纹图谱能够直观地反映根际微生物的变化，它是一种能够提供微生物群落结构变化的研究方法，为了进一步分析其多样性，还需要对DGGE条带进行切胶回收、克隆测序，后续试验正在进行当中。另外，利用基因组学、蛋白质组学等方法，对木霉菌、病原菌、人参三方的互作关系进行进一步研究，了解群落中占优势种群、病原菌种群的变化趋势，研制木霉菌新的生物制剂，会对人参病害的发生起到一定的预防作用，以期为克服人参连作障碍取得突破性进展。

参考文献：

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[7]高崇洋，赵阳国，王爱杰，等. 耕作和施肥对不同深度黑土中细菌群落结构的影响[J]. 微生物学报，2010，50（1）：67-75.

[8]张国荣，庞立杰，董宇. 关于人参栽培可持续发展的思考[J]. 人参研究，2007，19（4）：42-43.

[9]Huang X，Tian Y，Luo Y R，et al. Modified sublimation to isolate phenanthrene-degrading bacteria of the genera Sphingomonas and Burkholderia from Xiamen oil port[J]. Marine Pollution Bulletin，2008，57（6/12）：538-543.

[10]杨华，宋绪忠，尹光天，等. 黄藤ISSR反应体系的条件优化[J]. 福建林学院学报，2006，26（2）：152-155.

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[12]林万明，林万明. PCR技术操作和应用指南[M]. 北京：人民军医出版社，1993：7-14.

[13]李海生，陈桂珠. 红树植物海桑简单重复序列区间（ISSR）条件的优化[J]. 广东教育学院学报，2004，24（2）：80-83.

[14]Watanabe K，Kodama Y，Harayama S. Design and evaluation of PCR primers to amplify bacterial 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting[J]. Journal of Microbiological Methods，2001，44（3）：