烟草植物螯合肽合成酶PCS1基因的电子克隆和序列分析

付强++钟晓武邹颉+林世锋+郭玉双+赵杰宏+王轶+任学良

摘要：为了研究烟草中重金属镉的代谢转运基因，以马铃薯的植物螯合肽合成酶phytochelatin synthases 1（PCS1）基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：AJ548472.1）为信息探针，通过电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），并对其进行了序列分析。序列分析结果：NtPCS1包含完整的开放读码框，编码531个氨基酸，含有2个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin；通过同源比对和进化分析发现，NtPCS1氨基酸序列与番茄PCS1的序列一致性达到85%，与已报道的树烟草NgPCS相比，在N端多出30个氨基酸。以上结果表明NtPCS1是栽培烟草中新发现的金属镉代谢转运基因。

关键词：栽培烟草；植物螯合肽合成酶；镉转运

中图分类号： Q785；S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0034-04

收稿日期：2013-09-11

基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目（编号：黔科合NY字[2011]3047号）；中国烟草总公司重点项目（编号：中烟办[2010]221号）；中国烟草总公司重大专项（编号：中烟办[2012]146号）。

作者简介：付强（1984—），男，贵州赤水人，博士，助理研究员，主要从事烟草遗传育种与蛋白质组学研究。E-mail：nesta1984fu@sina.com。

通信作者：任学良，男，博士，研究员，研究方向为烟草基因组学。E-mail：renxuel@126.com。当环境受到镉污染后，镉便在生物体内富集，并通过食物链进入人体而引起慢性中毒。镉被人体吸收后，可在人体内形成镉硫蛋白，并选择性地蓄积在肝、肾中，其中肾脏可吸收近1/3，是镉中毒的“靶器官”。镉在人体内的生物半衰期达到30年之久，往往会引起慢性毒性[1]。通过对我国烟叶主产区的重金属含量调查发现，镉是我国烟叶中的主要重金属元素，含量远高于铅、汞、砷等，平均含量达到2.95 mg/kg[2]。随着人们对健康生活关注度的提高，烟草中镉含量已经成为烟草行业关注的热点。

烟草中的镉来源于土壤，即便是在镉污染不是很严重的土壤中，烟草仍然能够通过根吸收镉，然后被吸收的镉再通过一些转运蛋白进入烟草的各个组织，从而导致镉在烟草中大量富集；此外，植物中负责转运锌、铁金属离子的转运蛋白也有运输镉的功能[3]。植物螯合肽（phytochelatins，PCS）是一种谷胱甘肽衍生的金属结合肽，在多种植物中扮演着解除镉和砷毒性的作用，近期的研究报道，植物螯合肽参与镉在韧皮部中的长距离运输。植物螯合肽的形成需要植物螯合肽合成酶的催化，而植物螯合肽合成酶基因已经成功在植物、真菌和线虫中得到克隆[4-8]。但是植物螯合肽在栽培烟草中是否存在仍然未知，并且如果在烟草中存在，其在镉代谢过程中扮演的角色也值得研究。

电子克隆（in silico cloning）是近年来伴随着基因组计划和 EST 计划而发展起来的新的基因克隆方法[9-12]，其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列，获得基因的部分乃至全长cDNA序列。本研究采用电子克隆的方法获得了1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），并对其进行生物信息学分析，为进一步研究烟草中镉的转运代谢奠定了基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究中所用烟草的基因序列均由GenBank提供。

1.2烟草PCS1基因的电子克隆

以马铃薯的phytochelatin synthases 1（PCS1）基因全长cDNA序列（GenBank登录号：AJ548472.1）为信息探针[13]，对GenBank中EST_others数据库的普通烟草（Nicotiana tabacum）进行BLAST检索，并参考菲莫公司的林烟草和绒毛状烟草的全基因组测序结果[14]，使用Codon Code Aligner软件对检索到的来自美国普通烟草的全部EST序列进行拼接，形成重叠群（contig）。利用拼接获得的重叠群作为探针，再次进行同源检索、拼接。重复以上过程直至没有更多的EST被检出，最终获得美国普通烟草的PCS1 cDNA序列，最后再用此序列片段在GenBank中进行BLAST比对，分析与其他物种同源基因的相似性和一致性，检验拼接所得cDNA片段的正确性以及读码框（open reading frame，ORF）序列的完整性。

1.3烟草PCS1基因的生物信息学分析

序列比对、ORF查找和翻译均在 NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的相应模块上完成。利用 ExPASy 网站上的Prot-Param、pI/Mw操作对蛋白质的理化性质进行基本分析；利用在线资源SignalP 4.1、TargetP 1.1、NetOGlyc 4.1、NetNGly 1.0、NetPhos和SOPMA软件进行信号肽、糖基化位点、磷酸化位点和蛋白二级结构的分析；利用clustalX 2.0、MEG A4.0软件进行氨基酸序列比对和进化树分析。

2结果与分析

2.1烟草栽培品种PCS1基因的电子克隆

利用马铃薯PCS1基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：AB559522）为检索探针，对GenBnak中的烟草EST数据库进行BLAST检索分析，同时比对菲莫公司2013年发布的烟草基因组测序数据[14]，发现18条一致性和相似性较高的EST序列。按照“1.1”所述方法进行重叠群分析，结果显示，18条EST可拼接成1条独立的cDNA序列，长度为1 596 bp，暂命名为NtPCS1（Nicotiana tabacum PCS1））。

2.2NtPCS1蛋白的基本参数和可能的翻译后修饰

NtPCS1蛋白的长度为531个氨基酸，分子量为

58.36 kDa，等电点（pI）为 6.44。在氨基酸组成上，酸性氨基酸（天门冬氨酸+谷氨酸）有56个，占10.5%；碱性氨基酸（赖氨酸+精氨酸）有52个，占9.7%；含量最丰富的为亮氨酸（Leu），占总氨基酸的11%，其次是丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala），分别占8.9%、8.1%。NCBI保守域检测表明，NtPCS1蛋白含有 2 个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin，说明所克隆的NtPCS1 基因是植物螯合肽合成酶基因家族成员）。分析还表明：NtPCS1蛋白质不稳定指数为41.79，属于不稳定蛋白；脂溶指数为88.53，总平均亲水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.087，具有轻度疏水性。采用 SignalP 4.1对NtPCS1蛋白进行预测[15]表明，NtPCS1蛋白无信号肽。利用TargetP1.1在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对推导蛋白的定位特性分析[16]显示，NtPCS1 没有特殊的定位偏好性。用NetOGly 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGly 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）进行预测的结果表明，NtPCS1 没有信号肽，即便是具有5个O-糖基化位点，也不会发生O-连接糖基化，但是在第64、154、323位氨基酸可能发生N-糖基化，这3个糖基化位点位于NtPCS1蛋白质的保守功能结构域里，对蛋白的功能可能起着重要作用。NetPhos2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测表明，NtPCS1蛋白存在20个磷酸化位点，其潜在的Ser、Thr、Tyr活性位点数分别为 14、4、2个。NtPCS1蛋白存在着丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对PCS家族的蛋白活化起着重要作用。

2.3NtPCS1蛋白的二级结构分析

通过SOPMA方法预测的NtPCS1蛋白质的二级结构如图3所示。可以看出，参与α-螺旋的氨基酸含量达到501%（266 个）；177 个氨基酸可能参与形成无规则卷曲，占33.3%；另外有55个氨基酸可能参与延伸链，占10.4%；33个氨基酸可能参与β-转角，占6.2%。以上分析表明，α-螺旋和无规则卷曲是NtGT5a蛋白质的主要结构。

2.4NtPCS1基因同源性分析和系统进化树分析

为了分析NtPCS1与其他植物的植物螯合肽合成酶基因的同源性，在NCBI数据库中对NtPCS1进行了BLASTN。结果表明，NtPCS1与番茄的StPCS1、StPCS18、StPCS16、StPCS19和山莴苣的LsPCS1基因具有较高的核苷酸序列同源性，说明该基因应该是一个与重金属离子的吸收转运相关的新基因。同时BLASTP分析发现，NtPCS1所编码的蛋白质氨基酸序列与番茄同源基因的氨基酸相似性最高，达到85%以上；与树烟草相比，NtPCS1在N端多出30个氨基酸[4]。另外研究表明，NtPCS1与葡萄、蓖麻、可可、杨树、大豆、拟南芥的植物螯合肽合成酶基因也有较高的同源性，同源性分别为73%、68%、68%、67%、63%、60%。从GenBank上获得的多个植物PCS同源基因编码蛋白的氨基酸序列，经过clustalX 2.0比对后生成aln比对文件，然后利用进化分析软件MEGA 4.0，并采用中邻位相接（Neighbor-Joint）算法构建系统进化树[17-18]。分析结果表明，栽培烟草中的PCS蛋白与茄科植物PCS基因编码蛋白的进化关系更近；而在同科植物中，与树烟草、番茄和马铃薯的同源基因相比，烟草栽培品种的PCS蛋白与树烟草的PCS蛋白同源性更高，在进化关系上更近。

3结论与讨论

许多研究表明，植物螯合肽在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用。Grill等早在1987年发现，在10多种高等植物中，PCS能结合植物所吸收的90%镉[19]。还有研究发现，PCS通过与植物根部吸收的镉形成复合物，能够减少镉离子对植物的毒害，从而增强植物抵抗镉胁迫的作用。

相较于其他高等植物，烟草具有更强的镉吸收累积特性，这与烟草对污染土壤中镉胁迫产生的耐性有关。Davis的研究表明，当土壤镉含量为69mg/kg时，烟草植株中镉的含量

是菠菜、莴笋的3倍[20]。烟叶中的重金属含量是由其生存的土壤中带入，而不是在生产加工过程中人为添加，而土壤中的镉、镍、铅等重金属元素的含量和pH值是呈负相关的，因此土壤越酸，重金属的含量也就越多。西南地区是我国酸雨最严重的地区，贵州的贵阳、都匀等地的酸雨量则更为严重，1982年都匀城区曾监测到降水pH值为3的惊人记录，因此这些地方的重金属含量有可能较高。吸烟时重金属对人体的危害，大大高于消化道的吸收量，因为在香烟不完全燃烧时即发生了一系列热分解与热合成化学反应，燃烧时的高温便将烟草中的重金属、类金属衍变为烟尘和雾（气溶胶），并直接由人体呼吸道进入体内，该过程包含了吸烟者和被动吸烟者，因此烟草中镉含量已经成为健康等领域关注的热点。

已有文献报道在植物中表达与PCS1合成途径相关酶的基因，能够增加PCS1的含量，并且提高植物对重金属的抗性和累积量[21]。本研究通过电子克隆方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），为利用此基因培育低镉富集的植物奠定理论基础。

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