超高倍多媒体显微仪检测沙眼衣原体及支原体的可靠性研究▲

陈巧佩 李颖丰 倪少娟 唐玉群 周春浪 佘尚扬

(广西壮族自治区妇幼保健院，广西壮族自治区妇产医院，南宁市 530003)

超高倍多媒体显微仪检测沙眼衣原体及支原体的可靠性研究▲

陈巧佩 李颖丰 倪少娟 唐玉群 周春浪 佘尚扬*

(广西壮族自治区妇幼保健院，广西壮族自治区妇产医院，南宁市 530003)

目的探讨超高倍多媒体显微仪直接镜检法在检测衣原体、支原体感染上的可靠性。方法取女性宫颈分泌物直接涂片后置于超高倍多媒体显微仪(MMDI)镜下直接观察涂片，抽取MMDI支原体、衣原体阳性标本及阴性标本各132例，再用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测沙眼衣原体(CT)和解脲脲原体(UU)，以PCR为“金标准”分析MMDI的检测灵敏度及特异度。结果纳入实验的132例超高倍显微仪镜检阳性的标本中，PCR-荧光探针法显示CT阳性者12例，UU阳性者59例，36例为CT和UU均阳性，25例为PCR阴性；132例MDDI检测为阴性的样本其PCR-荧光探针法检出CT或UU阳性4例。结果判定改为支原体、衣原体是否阳性后，MMDI和PCR结果经成组卡方检验表明两种检测方法的结果有很好的相关性。以PCR作为金标准，264例结果分析MMDI检测支原体、衣原体的方法学性能，得MMDI的灵敏度为96.40%，特异度为83.66%，阳性结果预期值为81.06%，阴性结果预期值为96.97%。总有效率为89.02%。结论超高倍多媒体显微仪直接镜检法(MMDI)在快速筛查支原体、衣原体感染上具有不可取代的优势，尤其是在支原体、衣原体的排除诊断中具有极其重要的价值；MMDI技术能对分泌物的整体微生态状态进行评价，为疾病诊断提供全面的病理信息；MMDI技术在区分衣原体、支原体上尚存在不足，对于MDDI筛选出的支原体、衣原体阳性标本可通过PCR进一步鉴定。

超高倍显微仪；聚合酶链反应；解脲脲原体；沙眼衣原体

非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)也称非特异性生殖道感染(non-specific genital infection，NSGI)，是指由淋菌以外的其他病原体，主要是沙眼衣原体(ChlamydiaTrachomatis，CT)、尿素分解支原体(UreaplasmaUrealyticum，UU)所引起的尿道炎，是最常见的性传播疾病之一。通常NGU的概念包括男性的非淋菌性尿道炎和淋病后尿道炎以及女性的非淋菌性尿道炎和非淋菌性宫颈炎。目前，性传播疾病(STD)在我国的发病率呈不断上升趋势，2000年全国报道该病在我国重点防治的8种主要性传播疾病中已升至第二位[1，2]，其中沙眼衣原体感染引起的STD还呈逐年上升趋势[3]。因此，有必要建立一种快速、准确的支原体、衣原体筛查方法。

超高倍多媒体显微仪(multimedia microscopy diagnostic instrument，MMDI)直接镜检法可以进行分泌物病原体筛查、尿沉渣镜检、大便有形成分镜检及血液学形态相关检查等。该技术为诊断泌尿生殖道感染提供了一项快速、直观的新方法。为了探讨MMDI新技术在分泌物病原体筛查方面的可行性，尤其是在支原体、衣原体检测方面的性能，我们将其检测结果与PCR-荧光探针法进行了比较和分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010年10月至2013年7月广西壮族自治区妇幼保健院妇产科、妇科门诊及生殖中心就诊的女性患者668例，患者均疑为宫颈炎、尿道炎及不孕患者，年龄20～36岁。用无菌棉拭子取宫颈分泌物：首先用一根棉拭子擦去宫颈表面多余黏液，再用棉拭子插入宫颈1～2 cm处缓慢转动一周并停留10 s后，取出棉拭子置于无菌管中送检。经MMDI检测共选取264例样本，其中132例为取宫颈分泌物标本用MMDI镜检法筛查CT、UU阳性(组1有51例衣原体阳，组2有78例支原体阳，组3有3例衣原体、支原体均阳性)，132例为MMDI镜检非衣原体、支原体患者(组4)。该264例标本再行PCR-荧光探针法检测CT和UU。

1.2 主要仪器和试剂 超高倍多媒体显微分析仪为上海大众公司DZ-510型；核酸检测(PCR-荧光探针法)试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。采用美国ABI-5700定量PCR检测仪。

1.3 MMDI镜检 标本送检后即时用无菌生理盐水涂片，加盖玻片，在放大12 000倍的相差视野下观察CT形态。观察到以下特点之一即判断为衣原体阳性：① 在柱状上皮细胞内或移行上皮细胞内有许多做“布朗运动”的膜状圆形颗粒(衣原体颗粒)，细胞内可见衣原体包涵体。包涵体为宿主细胞浆的空泡内充满始体和原体所形成[4]，高倍镜下为内膜环绕的空泡内有数量不等的衣原体颗粒作“布朗运动”；②观察到衣原体包涵体随胞膜破裂释放出细胞外[5～7]。见图1和图2。观察到以下特点：实体的小颗粒结构，但是单个的很难观察肯定，一般都是聚集成团形成包囊，包囊无细胞核，其大小是中性粒细胞的1/2～2/3大小，包囊内颗粒较均匀，呈翻滚样运动。即可判断为支原体阳性[8～10]。见图3～图4。

图1 柱状上皮内衣原体相差视野×12 000

图2 衣原体包涵体从细胞内释出相差视野×12 000

图3 支原体相差视野×12 000

图4 支原体相差视野×12 000

1.4 荧光探针定量PCR 该法除了常规引物外，PCR反应体系中含能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。反应中产生的游离荧光标记物和PCR产物的量成正比。DNA提取及荧光定量PCR反应条件严格按照试剂盒操作进行。每次检测均设3个阳性对照、3个阴性对照，均按试剂盒提供的定量阳性质控标准品做定量阳性质控，行PCR扩增后进行结果分析。实验灰度区采取重复实验，严格按照说明书进行结果判定。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理，计数资料采用χ2检验或配对卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMDI镜检法 668例宫颈分泌物标本，共检出CT、UU阳性132例，MMDI镜检法两种病原体总阳性检出率为19.76%。

2.2 荧光探针定量PCR法 132例MMDI镜检法阳性的样本中，PCR-荧光探针法显示CT阳性者12例，UU阳性者59例，36例为CT和UU均显示阳性，PCR两种病原体总阳性检出率为16.02%，CT感染率为7.19%，UU感染率为14.22%，其中单项感染占66.36%，合并感染占33.64%。两种方法的对应结果见表1。

表1132例MMDI阳性样本与PCR法检测结果比对(n)

此外，132例阴性对照中，检出沙眼衣原体或支原体阳性4例。MMDI的真阴性率约为96.97%。

2.3 MMDI和PCR法检测结果 MMDI和PCR的阳性结果不区分支原体和衣原体，只要检测到支原体或者衣原体均判定为阳性，两种检测方法的结果有很好的相关性。两种检测方法的检出率差异有统计学意义。另，以PCR作为金标准，以这264例结果分析MMDI检测支/衣原体的方法学性能，可得出MMDI的灵敏度为96.40%，特异度为83.66%，阳性结果预期值为81.06%，阴性结果预期值为96.97%，总有效率为89.02%。见表2。

表2264例样本MMDI镜检法与PCR法结果比较(n)

3 讨 论

衣原体和支原体都是原核细胞型微生物，体积均较小，形态特征有一定的相似性，在超高倍镜下明确区分两者有一定难度。

我们的研究中MMDI判定为衣原体阳性的51例标本中有8例PCR为UU阳性，22例为CT和UU同时阳性；MMDI判定为支原体阳性的78例标本的PCR结果中也有2例CT阳性，12例CT和UU同时阳性。依据我们用MMDI判定衣原体、支原体的标准及区别：衣原体为专性细胞内寄生，宫颈柱状上皮细胞为易感细胞。超高倍镜检必须在柱状上皮细胞或移行上皮细胞内见到衣原体包涵体或数量不少的衣原体颗粒才能判断为CT阳性。超高倍镜检观察到游离包囊，包囊内有呈翻滚样运动，大小较均匀的颗粒判断为支原体阳性。我们的研究表明，MMDI技术在区分衣原体和支原体上仍然存在缺陷。支原体包囊存在于细胞外，衣原体包涵体在细胞内外都有存在，但由于脱出细胞外的衣原体、包涵体与支原体包囊两者在大小上相似，仅靠形态学不能很好的区分。此外，支原体并非完全是表面寄生菌，在近期的研究中发现，支原体也可进入上皮细胞的核和细胞浆中繁殖[10]，这可能也是造成我们研究中MMDI检测在形态学上判定为衣原体而PCR检测为支原体的原因之一。

一般而言，对衣原体感染有效的药物对支原体感染也有效。这使得区分两者的意义并不是很大，因此，我们后面的数据统计没有再区分支原体、衣原体感染，将判定阴阳的标准改为支/衣原体阴性或者阳性。改变判定标准后MMDI结果和PCR结果进行成组卡方检验结果显示P<0.05，可以认为两种检测方法的结果有很好的相关性。但，配对χ2检验(McNemar Test)，P<0.05(双侧)可认为两种检测方法的检出率差异有统计学意义。这一结果提示我们，若MMDI镜检所见不是典型形态特征的时候，其阳性结果需要进一步用PCR确定。利用MMDI技术对分泌物进行检测而未经PCR确认的结果时将支原体、衣原体统称为支/衣原体来报告更为合适。我们的研究中132例MMDI检测为非支原体、衣原体感染的患者对应的PCR结果只有4例阳性，在这132例MMDI检测为阴性的样本中用PCR验证可知其真阴性率可达到96.97%，表明MMDI法虽然存在一定比例的假阳性，但是却能够很好的排除支原体、衣原体感染。另外，以PCR作为“金标准”，以这264例结果分析MMDI检测支/衣原体的方法学性能，可得MMDI的灵敏度为96.40%，特异度为83.66%，阳性结果预期值为81.06%，阴性结果预期值为96.97%。这组数据说明MMDI在检测支/衣原体的感染中具有灵敏度高于特异度，阴性预期值高于阳性预期值的特点。因此，MMDI在排除支、衣原体方面具有很大价值。也说明该技术在筛查支、衣原体上会有很大的应用空间。本研究结果MMDI的阴性预期值和徐喜林[11]的研究结果中该指标相近，但阳性预期值低于该报道。

荧光定量PCR融合了PCR核酸扩增和特异性荧光探针的技术特点，具有高敏感和高特异的优点。近年来的研究表明，该法是目前准确性及重复性均得到国际公认的核酸分子定量定性检测的标准方法[12，13]。此外，PCR结果表明，纳入研究的132例MDDI阳性标本中有25例其PCR为阴性结果，究其原因可能是我们本次PCR所检测的是支原体和衣原体都只是在生殖道发病率最高的解脲脲原体、沙眼支原体，而实际上除了这两种以外还有其他种类的支原体或者衣原体，如人型支原体(M.humenis，MH)、生殖支原体(M.genitalium，MG)、副衣原体(Parachlamydiaceae)等。此外，虽然PCR具有很高的灵敏度，但是由于样本中存在的PCR抑制物及PCR在检测活动期感染方面存在缺陷等都可能导致PCR结果出现假阴性。本研究表明PCR技术能够很好地区分衣原体、支原体感染。

本研究表明，支/衣原体在本院妇科门诊及生殖中心就诊的女性患者中的阳性检出率为16.02%，衣原体感染检出率约为7.19%，支原体的检出率约为14.22%。该结果和国外报道的衣原体在宫颈的感染率为4%～33%一致[14]，其具体的感染率区别和所检测的人群相关，在性传播疾病及不孕患者中感染率更高[15]。造成支原体、衣原体检出率偏低的原因有很多，如衣原体寄生在上皮细胞内，采样若没有采到上皮细胞，势必造成假阴性，取材不当也可降低支原体的检出率。此外，实验操作如DNA提取不彻底等都可能造成假阴性。

回顾现有的检测支原体、衣原体的手段主要有三大类：即经典细胞生物学方法、免疫学方法和分子生物学检测方法。传统检测支、衣原体的方法技术要求高，操作复杂、费时，阳性信息容易丢失。尤其是衣原体为专性细胞内寄生，培养法特异性高，但对设备及技术要求均高，所需时间长，且培养结果受培养细胞及环境影响[16～18]，如果标本培养前保存不当造成衣原体死亡，即使存在衣原体同样培养不出，因此不适于大规模应用于临床筛查，多用于科研和疑难病例的终鉴定。此外，上述方法无法提供生物体原位、直观的病变信息。直接免疫荧光法虽然可以在原位鉴定生物体信息，但该技术依赖生物体的免疫反应性且只能检测特定抗原抗体对应的病原体信息。传统的直接涂片镜检，将样本涂片通过碘或姬姆萨法等染色后观察细胞内包涵体，由于细胞内包涵体脆性较大，因而检测敏感性较低，而且该法的操作也不及MMDI简便。

MMDI技术集光学、光电学、电子学、医学影像学和多媒体计算机技术为一体，具有高放大倍数、高清晰度的特点，能清晰地直观生物体的动态和静态信息，无需染色，能够很好地保留细胞的完整性，因而能提供快速而敏感的像衣原体这种比较难培养的生物体的感染信息。此外，我们知道泌尿生殖道微生态非常复杂，有多种病原体如真菌、滴虫、加德纳杆菌、纤毛菌等，若采用PCR、FISH等分子生物学检测手段往往只能进行特定病原体的检测。通过MMDI技术我们可以在同一张涂片中观察到上皮细胞、多型核白细胞、细菌、真菌、滴虫等数量及形态，为临床诊断提供全面的分泌物整体微生态的状况描述信息，大大提高了多种病原体合并感染的检出率，是普通显微镜所无法比拟的，也是分子生物学检测手段目前无法完全替代的。我们研究表明MMDI在检测衣原体上有较高的灵敏度与其具有高放大倍数、高清晰度的特点相关，也和其能够综合判定阴道微生态的特点相关，因为一旦有衣原体的感染必然会引起整个阴道微生态的改变。

综上所述，MMDI技术在分泌物检查方面能够为临床快速、简便、全面地提供相关信息。此外，由于该项目只需要一台多媒体超高倍显微仪，经过形态学培训的操作人员，便可对常温常规制备的样品进行检测，这使得其检测费用也比分子生物学检测手段低很多。本研究的数据表明，其在排除支/衣原体感染中有极大的价值，因此该技术在临床上很值得作为一种快速过筛检测方法来推广。

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StudyonthereliabilityofdetectingChlamydiaTrachomatisandUreaplasmaUrealyticumbymultimediaultramicroscope

ChenQiaopei,LIYingfeng,NIShaojuan,TANGYuqun,ZHOUChunlang,SHEShangyang

(GuangxiMaternalandChildHealthCareHospital;GuangxiObstetricsandGynecologyHospital,Nanning530021,Guangxi,P.R.China)

ObjectiveTo analysis on the reliability of detecting Chlamydia Trachomatis(CT) and Ureaplasma Urealyticum (UU)by multimedia ultramicroscope.MethodsWe used multimedia ultramicroscope to detect the smear of cervical secretions. 132 CT or UU positive specimens and 132 negative specimens had been found and then all of them were detected by fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR). The sensitivity and specificity of the multimedia ultramicroscope assay were compared with those of the FQ-PCR using primers.ResultsIn 132 multimedia ultramicroscope positive specimens, FQ-PCR detecting showed 12 CT positive, 59 UU positive, 36 both CT and UU positive, and 25 totally negative. Among 132 multimedia ultramicroscope negative specimens, 4 were found CT or UU positive by FQ-PCR. Two methods showed good correlation when the decision criteria did not distinguish between CT and UU. Considering PCR as golden standard, the sensitivity and specificity of multimedia ultramicroscope were 96.40%, 83.66%, respectively, positive and negative predictive value were 81.06%, 96.97% respectively, and total effective rate was 89.02%.ConclusionsMultimedia ultramicroscope has irreplaceable advantages on rapid screening CT or UU infections, especially in excluding diagnosis. It can also evaluate the whole endovaginal microecologics and provide comprehensive pathological information for diagnosis. However, MMDI is still insufficient in distinguishing between CT and UU, which can be complemented by using PCR.

Multimedia ultramicroscope; Polymerase chain reaction; Ureaplasma urealyticum; Chlamydia trachomatis

广西自然科学基金(合同号：2010GXNSFA013225)

陈巧佩(1982～)，女，硕士，主管技师，研究方向：临床医学检验。

R 446.59

A

1673-6575(2014)05-0542-04

10.11864/j.issn.1673.2014.05.03

2014-07-06

2014-08-29)

*通讯作者