慢性束缚应激对大鼠睡眠时相的影响及酸枣仁汤的干预作用

张斌，张乔，马英男

(1.哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江 哈尔滨 150525;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150076)

人的一生大约有1/3的时间是在睡眠中度过的，所以睡眠的质量对维持机体健康状态至关重要。随着现代生活节奏的加快和工作压力的日益增大，在临床上常见由应激所导致的各种疾病［1］，且已有文献研究表明，慢性应激会对整个睡眠结构造成影响［2］。慢性束缚应激是使啮齿类动物产生应激的经典方法，国外已有慢性束缚应激对大鼠睡眠时相影响的文献报道［3］。然而目前国内慢性束缚应激的研究主要集中在模型复制后实验动物的行为学研究和生化指标含量的测定上［4］，未见采用多导生理描记技术研究其对睡眠时相影响的报道。酸枣仁汤出自《金匮要略》，主治“虚烦不眠”，是目前中医临床上常用的治疗失眠的经典基础方。

基于以上，本研究采用大鼠皮层脑电、肌电描记技术来考察慢性束缚应激对大鼠睡眠时相的影响，并在本课题组前期研究的基础之上，探讨了酸枣仁汤对慢性束缚应激所致大鼠睡眠时相改变的干预作用，以期为酸枣仁汤在临床上更广泛应用奠定前期实验基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar雄性大鼠，8月龄，清洁级，体质量(250±30)g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心(GLP实验室)提供，许可证号:黑动字第P00700619号。

1.2 实验仪器

十六道生理记录仪(MP－150型，美国BIOPAC公司);恒温恒湿自动光控电子屏蔽室 (8:00～20:00自动明暗控制，P－22型，常州第二无线电厂);脑立体定位仪(大鼠用，美国Stoelting公司);自凝牙科水泥(批号04－08－05，哈尔滨齿科器材厂);大鼠慢性应激束缚器(自制，有机玻璃材料，口径4cm，管壁有直径为0.5cm的通风口，确保大鼠呼吸通畅)。

1.3 主要试剂

戊巴比妥钠(批号WS20060401，国药集团化学试剂有限公司，临用时以生理盐水配制成0.5%溶液);注射用青霉素钠(批号A05065612，哈药集团制药总厂)。

1.4 实验药物

酸枣仁、茯苓、川芎、知母、甘草均经黑龙江中医药大学生药学教研室孙慧峰副教授鉴定，符合《中国药典》的规定。

2 实验方法

2.1 酸枣仁汤的制备

结合本课题组前期研究结果，按照酸枣仁汤中五味药的比例(酸枣仁∶茯苓∶川芎∶知母∶甘草 =18∶5∶10∶10∶5)，称取5 味药材共 456g，加 8 倍量的水，浸泡1h后，沸水煎煮30min，滤过，药渣再加6倍量水，沸后煎煮20min，滤过，合并两次滤液，浓缩至700ml，使每毫升浓缩液中含生药量的浓度为 0.65g/ml，备用。

2.2 大鼠皮层脑电与肌电电极的埋置

首先将Wistar大鼠在实验环境下适应1周后再进行脑电和肌电电极的埋置。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，待大鼠麻醉后，在脑立体定位仪上将其固定，剪掉头部毛，酒精消毒后，剪开头顶皮肤，拨开筋膜，用酸蚀剂腐蚀并充分暴露颅骨，用干脱脂棉擦净，直至颅骨表面干洁。在颅骨上用大鼠脑立体定位仪定位(坐标:AP －2，R2;AP+2，R2)，用牙科电钻钻孔，将2个直径为1mm不锈钢螺丝钉植入颅骨内，并使之与硬脑膜接触，但不穿透硬脑膜，作为脑电皮层电极;用两根酒精消毒后的导线穿过头后方的颈肌，作为肌电电极。将电极螺丝钉用焊锡制成微型插头，连接微型插座，在颅骨中间(坐标:AP+5，R0)钻孔，植入螺丝用以固定微型电极插座，然后以牙科水泥固定，缝合毛皮层［5－6］。大鼠电极埋置后将每只实验动物置于有机玻璃笼内单笼饲养，腹腔注射4万U青霉素钠，连续3天以避免手术造成感染，恢复7天后，按照下述方法进行造模。

2.3 慢性束缚应激大鼠模型的复制

将大鼠置于有机玻璃制成的束缚管中，管壁有直径为0.5cm的通风口，确保通风良好，大鼠能够自由呼吸，大鼠在束缚管中虽然活动收到限制，但不会造成肉眼可见的躯体上的伤害，大鼠每日束缚应激时间为6小时(9:00～15:00)，连续14天，应激时禁水禁食，应激结束后，将大鼠放回笼中自由进食和饮水［7－8］。

2.4 实验步骤

将24只Wistar雄性大鼠随机分为3组，即空白组、模型组和给药组，每组8只。模型组和给药组大鼠按照2.3项下的方法进行造模，空白组大鼠不做任何应激刺激，只是在另2组大鼠造模期间禁水禁食(9:00～15:00)。给药组大鼠自造模第1天开始灌胃酸枣仁汤16ml/kg，连续14天，空白组和模型组大鼠每日灌胃相同体积的生理盐水。

模型复制后，采用十六道生理记录仪描记每只大鼠12h(8:00～20:00)的脑电图(EEG)和肌电图(EMG)。实验环境控制为避光、通风、隔音、电磁屏蔽状态，采用自动定时光控系统对实验环境实行每天12h(8:00～20:00)的明暗光照周期处理，屏蔽室内温度(25±2)℃，相对湿度40% ～60%。

2.5 大鼠睡眠时相划分和定量分析指标

根据不同睡眠时相波形的特点［9］，将大鼠睡眠－觉醒周期分为觉醒(Wake)、浅睡期(LS)、慢波睡眠(SWS)和快动眼睡眠(REMS)等4个时相［10］。通过对大鼠EEG和EMG的分析，统计出每一类睡眠时相的持续时间和所占睡眠总时间的比例。实验数据采用SPSS 17.0软件包进行方差分析，设定P＜0.05为差异具有显著意义。

3 实验结果

3.1 慢性束缚应激对大鼠各睡眠时相持续时间的影响及酸枣仁汤的干预作用

由表1和图1可以看出，与空白组相比，模型组大鼠在睡眠总时间、LS、SWS以及REM睡眠的持续时间均显著缩短(P＜0.05)，由图1可以直观看出，SWS期睡眠持续时间缩短的幅度较大。与模型组相比，酸枣仁汤给药组大鼠在睡眠总时间、LS和SWS期睡眠持续时间均显著延长(P＜0.05)，REM期睡眠虽有延长的趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。

图1 慢性束缚应激对大鼠睡眠时相持续时间的影响及酸枣仁汤的干预作用

表1 慢性束缚应激对大鼠睡眠时相持续时间的影响及酸枣仁汤的干预作用(s)

表1 慢性束缚应激对大鼠睡眠时相持续时间的影响及酸枣仁汤的干预作用(s)

注:与空白组相比，*P ＜0.05;与模型组相比，#P ＜0.05。

组别 n 睡眠总时间(min)LS(min)SWS(min)REM(min)空白组 8 356.7 ±86.1 180.9 ±54.5 142.8 ±50.3 35.2 ±12.2模型组 8 176.4 ±66.8*103.0 ±42.5*41.9 ±10.6*19.4 ±5.7*给药组 8 260.3 ±77.6#145.0 ±70.1#93.1 ±44.8#22.5 ±7.3

表2 慢性束缚应激对大鼠睡眠各时相所占睡眠总时间比例的影响及酸枣仁汤的干预作用(s)

表2 慢性束缚应激对大鼠睡眠各时相所占睡眠总时间比例的影响及酸枣仁汤的干预作用(s)

注:与空白组相比，*P ＜0.05;与模型组相比，#P ＜0.05。

组别 n LS(%)SWS(%)REM(%)空白组8 50.7 ±4.6 40.8 ±10.3 9.8 ±3.5模型组 8 62.3 ±6.5* 25.2 ±8.7* 11.5 ±3.2给药组 8 55.7 ±5.1 35.8 ±9.1#8.6 ±3.9

图2 慢性束缚应激对大鼠睡眠各时相所占睡眠总时间比例的影响及酸枣仁汤的干预作用

3.2 慢性束缚应激对大鼠各睡眠时相所占睡眠总时间比例的影响及酸枣仁汤的干预作用

由表2和图2可见，与空白组相比，模型组大鼠LS期所占比例显著增加(P＜0.05)，SWS期睡眠所占的比例则明显减小(P＜0.05)，而REM期所占睡眠总时间的比例与空白组相比基本持平。与模型组相比，酸枣仁汤给药组大鼠SWS期所占睡眠总时间的比例显著提高(P＜0.05)，LS期和REM期睡眠所占比例虽有下降的趋势，但是在统计学上无差异(P＞0.05)。

4 讨论

应激是机体在受到各种内外环境因素刺激时出现的非特异性的全身反应。当处于应激状态时，机体需要调动各种代偿机制去应对应激对机体的损伤，由此引起一系列生理、生化的改变，而长期慢性应激可引起机体代偿机制失调，导致认知、情绪和内分泌系统的变化。已有研究证实，长期的慢性束缚应激可以影响大鼠体重的自然增长［11］，使大鼠自主活动减少［12］，表现出抑郁倾向，而且国外已有束缚应激对大鼠睡眠结构影响的报道［13］。酸枣仁汤是中医临床上具有改善睡眠作用的经典方剂，大量动物实验研究也提示酸枣仁汤可以改善由慢性情绪应激所导致的睡眠障碍［14－15］。基于上述思路，本研究通过大鼠皮层脑电和肌电电极的埋置，监测大鼠12h的EEG和EMG，进而探讨酸枣仁汤对慢性束缚应激所致大鼠睡眠结构改变的干预作用。

在复制大鼠慢性束缚应激的模型之前，先对大鼠进行皮层脑电和肌电电极的埋置，这一步骤十分关键，在用牙科电钻穿透大鼠头骨时的力量要拿捏适度，目的是刚好穿透大鼠头骨，又不损伤脑膜，另外要确保大鼠暴露的头骨用酸蚀剂擦拭得表面干洁，以便牙科水泥更好的固定，防止电极脱落。

LS期表示机体处于一种浅睡状态;而SWS期睡眠则是深睡眠状态，这一期对于缓解躯体上的疲劳有着十分重要的作用;当机体处于REM期睡眠时，表明机体正处于“做梦期”，它对于缓解机体脑疲劳有十分重要的意义，这一期睡眠可以促进记忆的巩固和儿童智力的发育。正常的睡眠结构应该是各睡眠时相保持一定的持续时间并且占有相应的比例，如果睡眠的持续时间减少或者各个睡眠时相比例严重失调，就会影响睡眠的质量。由本实验结果可以看出，慢性束缚应激可以明显缩短大鼠睡眠总时间、LS、SWS以及REM睡眠的持续时间，并改变了大鼠各睡眠时相所占睡眠总时间的正常比例，此时大鼠各睡眠时相间的平衡已被打乱，这和国外文献报道的结果较为相似［13］;而酸枣仁汤可以明显对抗慢性束缚应激对大鼠睡眠结构造成的影响，表现为延长各睡眠时相的持续时间，部分恢复其所占睡眠总时间的比例。

本研究初步阐明了慢性束缚应激对大鼠睡眠结构的影响，并从动物实验角度明确了酸枣仁汤的药效学基础，这为本研究后续实验，从神经递质的层面来探讨酸枣仁汤对抗慢性束缚应激所致睡眠障碍的机制奠定了前期研究基础。

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