正常大鼠胆管细胞胆汁酸转运蛋白表达的异质性

程 龙，骆助林，向 珂，赵礼金

(1.成都军区总医院 全军普通外科中心，四川 成都 610083；2. 遵义医学院附属医院 肝胆外科，贵州 遵义 563099)

胆管树是一个不同管径的、相互交通的三维网络，从赫氏管向肝外肝胆管延伸。而被覆胆管的上皮细胞在发育上、结构上、功能上是一个不均一的细胞群体[1- 2]。胆管细胞对胆汁中胆盐重吸收的异质性在胆管细胞生理及病理过程中具有重要意义[3]。胆管细胞胆盐重吸收功能的异质性决定于胆盐转运蛋白表达的差异。然而，目前尚无胆盐转运蛋白在大、小胆管中表达差异的对比研究。本研究重点检测和分析顶侧钠依赖性胆汁酸转运体(Apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT)、回肠胆汁酸结合蛋白(Ileum bile acid binding protein, IBABP)和基底侧有机溶质转运体α(Organic solute transporter alpha OSTα)等胆汁酸转运蛋白在大鼠不同节段胆管中的表达差异，为研究胆管细胞胆盐重吸收异质性在胆管疾病发生中的作用奠定理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄雄性Spragure-Dawley(SD)大鼠，二级动物，体重200～250g，购于第三军医大学大坪医院实验动物中心。大鼠饲养于恒温、清洁环境，维持12h昼夜节律，遵守实验动物使用及管理原则。

1.2 大、小胆管的分离 参考我们前期研究中的肝内胆管分离方法[4]。SD大鼠麻醉后(戊巴比妥，50 mg/kg)，取上腹部横切口逐层进腹；22G留置针行门静脉穿刺置管，用D-Hank’s持续灌注5min后，换用含0.05%IV型胶原酶的D-Hank’s液继续灌注10 min；移出肝脏置于胆管细胞生长培养基中(含DMEM/F12=1∶1基础培养基中加入10%胎牛血清，100 U/L青-链双抗，400 μg/L地塞米松，10 g/L胰岛素，25 μg/L表皮生长因子)，钝性分离以去除肝实质及肝静脉，剩余肝内胆管树部分；在手术显微镜下将胆管树分为大胆管和小胆管两部分组织，即以第三级胆管分支末端为界，近端为小胆管组织，远端为大胆管组织(见图1A～B)，胆管组织存于液氮中用于蛋白及RNA提取。

1.3 免疫组织化学检测胆管细胞胆盐转运蛋白的表达 通过免疫组织化学法检测大鼠肝胆管ASBT、IBABP及Ostα的表达。一抗分别为：ASBT, Santa cruz,1∶200；IBABP, Santa cruz, 1∶200； Ostα, Abcam, 1∶100。PBS液代替一抗作为阴性对照。选用SABC免疫组织化学检测试剂盒进行染色，光学显微镜下分别观察。

1.4 RNA提取和Real-time PCR检测 采用RNAiso Plus提取总RNA，PrimscriptTMRT reagent Kit 逆转录，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅲ试剂盒行Real-time PCR，引物序列和产物大小(见表1),由上海生工生物工程技术服务有限公司负责合成。反应条件及试剂均参照说明书进行。根据电泳结果确保所得产物，采用制作标准曲线的方法得到数据。

1.5 蛋白提取和Western blot检测 胆管蛋白的提取参考既往文献[4]。提取蛋白置于-80 ℃保存，应用BCA试剂盒检测蛋白浓度。每孔道上样50 μg，8%SDS-PAGE凝胶电泳20 V，2h后80 V，3 h。200 mA转膜2 h至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，室温下孵育一抗(ASBT, 1∶500；IBABP, 1∶500； Ostα, 1∶1 000)、二抗2 h，应用发光试剂显影及X胶片成像。扫描胶片后应用Quantity One软件进行灰度测定。

注：A：大鼠胆管树的实物图：利用胶原酶灌注消化辅助机械分离方法获得完整的胆管树，完整的大鼠胆管系统包括:①尾状叶,②右叶,③中叶,④左中叶, ⑤左外叶及⑥盘状突的分支系统；B：大鼠大、小胆管分离的模式图：在手术显微镜下，以三级胆管分支末端(虚线)为界将胆管组织分为两部分，靠近肝门的部分主要含有大胆管，周围的部分主要含较小胆管。 图1 大、小胆管的分离方法

表1引物序列及产物大小

基因名称引物温度长度ASBT上游 5’-CAGTTTGGAATCATGCCTCTC-3’ 下游 5’-AAGGGGCATCATTCCAAGAGC-3’56℃207bpIBABP上游 5’-CTTCACCTGGTCCCAGTCT-3’下游 5’-CAACTTGTCACCCACGAC-3’55℃187bpOstα上游 5’-CCCTCATACTTACCAGGAAGAAGCTAC-3’下游 5’-CCATCAGGAATGAGAAACAGGC-3’58 ℃109bpβ-actin上游 5’-ATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3’下游 5’-TCTTGCTCTGGGCCTCGTC-3’57℃174bp

2 结果

2.1 ASBT在正常大鼠胆管中的表达 免疫组织化学显示ASBT表达于胆管上皮细胞顶侧细胞膜，且主要表达于大胆管，随着胆管直径变小，其表达量也逐渐降低，至汇管区周围小胆管几乎无表达(见图2A～B)。Real time PCR检测结果显示，大、小胆管组织中ASBT mRNA的相对表达量分别为0.59±0.10和0.26±0.07；Western blotting检测结果显示，大、小胆管组织中ASBT蛋白的相对表达量分别为0.84±0.21和0.49±0.18。统计分析表明，大胆管中ASBT的mRNA和蛋白表达水平均显著高于小胆管(P<0.05，见图2C～D) 。

注：A：免疫组织化学显示ASBT表达于大胆管上皮细胞顶侧细胞膜，IHC×400；B：随着胆管直径变小，ASBT其表达量也逐渐降低，至汇管区周围小胆管几乎无表达，IHC×400；C：Real time PCR结果显示大胆管中ASBT的mRNA表达水平显著高于小胆管；D：Western blotting结果也显示大胆管中ASBT的蛋白表达水平显著高于小胆管。 图2 正常大鼠大、小胆管中ASBT的表达差异

2.2 IBABP在正常大鼠胆管中的表达 免疫组织化学显示IBABP表达于胆管上皮细胞胞浆内，主要表达于大胆管，随着胆管直径变小，其表达量也逐渐降低，至汇管区周围小胆管几乎无表达(见图3A～B)。Real time PCR检测结果显示，大、小胆管组织中IBABP mRNA的相对表达量分别为0.66±0.12和0.20±0.06；Western blotting检测结果显示，大、小胆管组织中IBABP蛋白的相对表达量分别为0.56±0.11和0.17±0.08。统计分析表明，大胆管组织中IBABP的mRNA和蛋白表达水平均显著高于小胆管(P<0.01，见图3C～D)。

注：A：免疫组织化学显示IBABP表达于大胆管上皮细胞的细胞浆内，IHC×400；B：随着胆管直径变小，IBABP其表达量也逐渐降低，至汇管区周围小胆管几乎无表达，IHC×400；C：Real time PCR结果显示大胆管中IBABP的mRNA表达水平显著高于小胆管；D：Western blotting结果也显示大胆管中ASBT的蛋白表达水平显著高于小胆管。 图3 正常大鼠大、小胆管中IBABP的表达差异

2.3 Ostα在正常大鼠胆管中的表达 免疫组织化学显示Ostα表达于胆管上皮细胞基底侧膜上，大、小胆管表达无显著差异，且Ostα也表达与肝细胞血窦面(见图4A～B)。Real time PCR检测结果显示，大、小胆管组织中Ostα mRNA的相对表达量分别为0.39±0.05和0.52±0.06；Western blotting检测结果显示，大、小胆管组织中Ostα蛋白的相对表达量分别为0.72±0.12和0.83±0.21。统计分析表明，大、小胆管组织中Ostα mRNA和蛋白的表达水平均无统计学意义(P<0.01，见图4C～D)。

注：A：免疫组织化学显示Ostα表达于大胆管上皮细胞基底侧胞膜，IHC×400；B：Ostα在小胆管细胞中也有表达，主要位于胆管上皮细胞基底侧胞膜，表达量与大胆管无统计学意义，IHC×400；C：Real time PCR结果显示大、小胆管中Ostα的mRNA表达水平无统计学意义；D：Western blotting结果也显示大、小胆管中Ostα的蛋白表达水平无统计学意义。 图4 正常大鼠大、小胆管中Ostα的表达差异

3 讨论

越来越多的研究证实胆管细胞在形态和功能上存在异质性[1-2]。本研究着眼于胆管细胞胆盐转运及其相关蛋白表达的差异。胆管细胞顶侧面暴露于高浓度的胆汁酸，胆管细胞与胆汁酸之间存在相互作用。胆管细胞顶侧细胞膜表达一种钠依赖性的胆汁酸转运体(ASBT)，胆汁中胆汁酸可经ASBT进入胆管细胞，在细胞内与胆汁酸结合蛋白(IBABP)结合，从细胞膜顶侧转运至细胞基底侧，经细胞基底膜上的胆汁酸转运蛋白将胆汁酸转运入胆管周围血管丛，从而进入门脉系统。经胆管细胞单向性转运入门脉系统的胆汁酸可经肝细胞重新分泌入胆汁，形成胆汁酸的胆肝循环[5]。近来研究表明，胆肝循环可能在胆汁酸的肝胆转运体系中具有重要作用，且参与了胆道梗阻引起的慢性胆汁淤积的适应性反应。胆汁酸从胆汁中转运入胆管细胞是胆汁酸胆肝循环的重要始动环节。目前胆管细胞顶侧膜表达的胆汁酸转运体只有ASBT得到公认。细胞基底侧的胆汁酸转运可能由MRP3和Ostα-Ostβ异二聚体完成，而研究表明Ostα-Ostβ异二聚体起主要作用，而MRP3起辅助作用。有研究报道ASBT主要表达于大胆管细胞[6]，而IBABP和Ostα-Ostβ在胆管组织中的表达情况尚无明确研究报道。

本研究通过免疫组织化学检测发现ASBT仅表达于直径大于15μm的大胆管的上皮细胞顶侧细胞膜上，而在直径小于15μm的小胆管的上皮细胞无表达，这与以往研究报道一致。IBABP也只表达于大胆管上皮细胞的细胞浆内，而不表达于小胆管细胞。与ASBT和IBABP不同，Ostα-Ostβ在大胆管和小胆管上皮细胞均表达，且都定位于胆管细胞基底侧细胞膜，同时在肝细胞的血窦面也可见表达。Western blot检测也显示在三级分支末端之前的较大胆管组织中ASBT和IBABP的表达显著高于其在三级分支末端之后的较小胆管组织的表达，而Ostα-Ostβ在两者中表达无统计学意义。以上结果表明，尽管Ostα-Ostβ在大小胆管均有表达，而在胆肝循环中起始动作用的ASBT以及IBABP只表达于大胆管，所以胆管细胞对胆汁酸的重吸收也只能发生于大胆管。

由于进入胆管细胞的胆汁酸可发挥信号分子的作用，引起细胞内Ca2+，PKC，PI3K，丝裂原激活蛋白(MAP)激酶和细胞外信号调节蛋白激酶等信号途径的改变，显著影响胆管细胞分泌功能，并在胆管细胞增生、凋亡及胆管周围纤维化过程中起重要作用[7-8]。 所以胆汁酸在胆管细胞中转运的平衡对维持胆管细胞正常生理功能和在免受胆汁酸毒性作用具有重要意义。在一些病理情况下，这种平衡可能会被破坏，引起胆管细胞的相应病理生理学改变，从而参与了胆管疾病的发生发展。本研究结果表明，胆汁酸重吸收可能只发生于大胆管，因此，胆汁酸转运不平衡而引起胆盐在细胞内异常聚集可能也只发生于较大胆管上皮细胞，从而参与了主要累及较大胆管的胆管病的发生发展。肝移植后缺血型胆管病变是主要累及三级以上大胆管的弥漫性病变，且有研究显示胆汁毒性在其发生发展中起重要作用[9-10]。且在我们前期研究中发现，肝移植后，胆管细胞胆盐转运蛋白表达呈现不平行的改变，且供肝冷缺血时间越长，这种不平行的程度越大，胆管损伤越重[4]。因此，我们推测，由于胆盐转运蛋白表达不平行导致了毒性胆盐中细胞内异常聚集而引起细胞损伤；而由于胆盐转运主要发生在大胆管，因此肝移植后缺血型胆管病主要发生在大胆管。然而，这一推测尚需要进一步深入研究证实。

综上所述，由于ASBT和IBABP只表达于大胆管上皮细胞，Ostα同时表达于大胆管和小胆管上皮细胞，因此，胆管细胞对胆汁酸的重吸收主要发生于大胆管。研究胆管细胞胆盐转运的差异与胆管疾病发生的关系及分子基础，不仅有助于阐明肝移植后缺血型胆管病的发生机制，而且也将为探索其他胆管疾病的发生发展机制提供新的思路。

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