芦荟大黄素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

张 琪，李郦芸，彭顺利，张吴琼，陈红杰， 李 妍

(吉林医药学院:1.2009级临床本科甲班，2.生物化学与分子生物学教研室，吉林 吉林 132013)

·论 著·

芦荟大黄素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

张 琪1，李郦芸1，彭顺利1，张吴琼1，陈红杰1， 李 妍2*

(吉林医药学院:1.2009级临床本科甲班，2.生物化学与分子生物学教研室，吉林 吉林 132013)

目的 研究芦荟大黄素对MPP+诱导的人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用。方法 采用体外SH-SY5Y细胞培养的方法，建立SH-SY5Y神经细胞MPP+损伤模型。通过观察细胞形态，测定细胞存活率(MTT法)，检测芦荟大黄素对SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。结果 同正常对照组细胞相比，MPP+损伤模型组细胞活性明显降低；同模型组比较，浓度为2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L的芦荟大黄素能减轻MPP+引起的SH-SY5Y神经细胞的损伤，明显提高细胞的存活率。结论 芦荟大黄素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。

芦荟大黄素；MPP+；SH-SY5Y 细胞

帕金森病(Parkinsons disease，PD)是临床上最常见的神经系统退行性疾病之一，常见于中老年人，主要是由于黑质多巴胺能神经元坏死、凋亡，使黑质-纹状体通路多巴胺释放减少，造成多巴胺-乙酰胆碱失衡[1]。多年来，国内外学者对PD发病机制进行了大量研究，虽然取得了一些成果，但其确切的机制仍不明确。长期以来，临床上以左旋多巴替代治疗为主，但也只能改善症状，不能阻止疾病的进展[2]。目前普遍认为遗传因素和环境毒物的共同作用启动或促发了氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白水解应激和免疫异常等多种机制，最终通过多种级联反应导致多巴胺能神经细胞凋亡。近年来，随着对PD机制研究的不断深入，发现中药能够通过抗氧化、抗炎作用延缓PD的进展。芦荟大黄素(Aloeemodin)是芦荟的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化及清除自由基等多种作用[3]。本实验以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为研究对象，用1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-pheny-lpyfidinium，MPP+)诱导建立SH-SY5Y神经细胞损伤模型，观察芦荟大黄素对SH-SY5Y细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系及细胞培养

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自于中国科学院上海生命科学研究院。细胞培养基为含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养，每2～3 d换液1次，待细胞浓度达到80%之后传代。

1.2 主要试剂与仪器

芦荟大黄素购自于中国药品生物制品检定所；DMEM 培养基购自于美国Hyclone公司；胎牛血清，元亨生物科技有限公司产品；MPP+、MTT、胰蛋白酶，均美国Sigma公司生产；二甲亚砜(DMSO)，由天津市大茂化学试剂厂提供；细胞培养箱，北京东方安若生化科技有限公司生产；超净台，购自于苏州净化仪器厂；酶标仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.3 芦荟大黄素对MPP+染毒的SH-SY5Y细胞生长增殖的影响

根据细胞处理不同，可分为对照组和模型组。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25%胰酶消化制成细胞密度为3×104个/mL的细胞悬浮液。以每孔200 μL接种于96孔板中，置于培养箱中常规培养。待细胞贴壁后，对照组只加入无血清培养基，模型组为含有浓度为1 mmol/L MPP+的无血清培养基，同时模型组还需加入不同浓度的芦荟大黄素，且芦荟大黄素的终浓度分别为0、2、4、6、8 μmol/L，每组设6复孔，继续培养48 h后测定细胞存活率。MTT法的测定：加入芦荟大黄素培养48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸弃上清液，加入DMSO 150 μL，振摇10 min，用酶标仪测定490 nm处吸光度值。

1.4 形态学观察

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25%胰酶消化制成细胞密度为3×104个/mL的细胞悬浮液。以每孔200 μL接种于96孔板中，置于培养箱中常规培养。待细胞贴壁后，按照1.3的方式进行加药，继续培养48 h，倒置显微镜下观察并照相；再加入MTT培养4 h，倒置显微镜下观察并照相。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 芦荟大黄素对MPP+染毒的SH-SY5Y细胞增殖能力的影响

与对照组相比，1 mmol/L MPP+损伤48 h使SH-SY5Y细胞的细胞活性明显下降，而与MPP+染毒组相比，浓度为2～8 μmol/L的芦荟大黄素均能减轻MPP+引起的SH-SY5Y神经细胞的损伤，明显提高细胞的存活率。表明芦荟大黄素对MPP+损伤SH-SY5Y细胞有一定的保护作用，可显著抑制MPP+的细胞毒性作用。

2.2 芦荟大黄素抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤后的形态学变化

将细胞置于倒置显微镜下，观察形态学变化：正常对照组细胞生长良好，细胞数较多，细胞间连接紧凑，单个细胞呈梭形，少数呈类三角形，细胞透光性好，MTT染色后结晶体数量多；MPP+模型组细胞密度显著降低，整个细胞的形态由梭形逐渐变为细长形、皱缩，细胞间连接较松，部分细胞轴突回缩，形态差异较大，最后细胞间隙增大，导致成片细胞间出现空白，透光率降低，MTT染色后结晶体数量明显减少；芦荟大黄素各组细胞透光率显著提高，边缘清晰，皱缩现象减轻，细胞数较MPP+组明显增多，细胞间连接较紧密，胞体突起较多，细胞透光性较好，外形较规则，成片细胞生长较均匀(见图1、2)。

A.对照组，B.1 mmol/L MPP+组，C～F.分别浓度为2、4、6、8μmol/L的芦荟大黄素

图 1 MTT染色前SH-SY5Y细胞(200×)

A.对照组，B.1 mmol/L MPP+组，C～F.分别浓度为2、4、6、8μmol/L的芦荟大黄素

图 2 MTT染色后SH-SY5Y细胞(200×)

3 讨 论

芦荟为百合科芦荟属植物，品种繁多，是一种药用价值很高的植物。芦荟以其独特的功效和广泛的用途受到人们的普遍关注，也是国内外研究的一大热点。因此，深入研究芦荟对相应疾病的治疗作用、开发其潜在的医疗市场势在必行。芦荟大黄素为芦荟有效活性成分之一，近年的研究表明芦荟大黄素具有抗肿瘤活性[4]、抗菌活性和免疫抑制作用[5]、泻下作用，并具有很好的抗氧化作用，但芦荟大黄素对于PD的药理作用研究未见报道。PD是临床上最常见的神经系统退行性疾病之一，迄今为止，PD 药物治疗以西药为主，但西药治疗效果不易巩固，且副作用较大。因此，筛选副作用较小，治疗效果明显的PD治疗药物或药物活性成分十分重要。SH-SY5Y细胞具有神经元和多巴胺能神经分泌细胞的性质，目前广泛用于神经退行性病变以及神经毒理方面的研究[6]。

本实验以MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤，观察芦荟大黄素对染毒细胞的保护作用。结果证实，芦荟大黄素可以显著增加MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤模型的细胞活性，有效减轻MPP+诱导细胞凋亡的发生，明显提高细胞的存活率。但芦荟大黄素的具体保护作用机制仍需进一步研究。

[1] 邓 敏，鞠晓东，樊东升，等.毛蕊花苷对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用[J].中国药理学通报，2008，24(10)：1297-1302.

[2] 张美蓉，魏守蓉，吴燕川，等.连翘苷对MPP+诱导人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的保护作用[J].神经药理学报，2011，1(4)：12-15.

[3] 雷秀霞，张 琼，李国豪，等.芦荟大黄素对PC12细胞骨架保护作用的实验研究[J].中国误诊学杂志，2011，11(23)：5555-5558.

[4] 史 朋，段开文.芦荟大黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[J].口腔材料器械杂志，2006，15(4)：217-219.

[5] 胡 芬，孙文武，宋志成，等.芦荟大黄素对Jurkat T细胞增殖和凋亡的作用及机制[J].中草药，2008，39(2)：231-236.

[6] Halvorsen E M,Dennis J,Keeney P，et al.Methylpyridinium(MPP(+))- and nerve growth factor-induced changes in pro- and anti-apoptotic signaling pathways in SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].Brain Res，2002，952(1)：98-110.

Effects of aloe-emodin on SH-SY5Y cells apoptosis induced by MPP+

ZHANG Qi1，LI Li-yun1，PENG Shun-li1，ZHANG Wu-qiong1，CHEN Hong-jie1，LI Yan2*

(Department of Biochemical,Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

Objective To investigate the effects of Aloe-emodin on MPP+-induced injury in SH-SY5Y neuroblastoma Cells. Methods The damage of cultured SH-SY5Y cells was made by MPP+.The protective effect of Aloe-emodin was observed by morphological identification,colorimetric MTT assay. Results Aloe-emodin(2 μmol/L,4 μmol/L,6 μmol/L,8 μmol/L)could relieve the damage of SH-SY5Y cells and increase the survival of the cells. Conclusion Aloe-emodin can strongly protect the cultured SH-SY5Y cells from damage induced by MPP+.

Aloeemodin;MPP+;SH-SY5Y cells

1673-2995(2014)01-0028-03

吉林医药学院大学生科研基金(201104)；吉林省科技厅科研项目(201205079).

张 琪(1990-)，女(汉族)，在读本科.

李 妍(1974-)，女(汉族)，副教授，博士.

R285

A

2013-11-17)