胡桃醌联合顺铂对肝癌HepG2细胞增殖的影响

那文婷，韩景春，吴亚猛 ，李博雅，陈飞儿，赵行宇

(吉林医药学院:1.临床医学院， 2.心理教研室，吉林 吉林 132013)

·论 著·

胡桃醌联合顺铂对肝癌HepG2细胞增殖的影响

那文婷1，韩景春1，吴亚猛1，李博雅1，陈飞儿1，赵行宇2*

(吉林医药学院:1.临床医学院， 2.心理教研室，吉林 吉林 132013)

目的 探讨胡桃醌与顺铂(DDP)联合应用对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法 采用不同浓度的胡桃醌或(和)顺铂处理肝癌HepG2细胞24 h,采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化，通过MTT法检测其对HepG2细胞生长的抑制作用。结果 不同浓度的药物作用可导致HepG2细胞发生形态学变化，MTT比色法测定显示，采用胡桃醌、顺铂合用，可显著抑制HepG2细胞的增殖，单用不同浓度的胡桃醌与顺铂分别作用于肝癌HepG2细胞后可以抑制其增殖且呈剂量依赖性。胡桃醌联合顺铂增强了HepG2细胞的凋亡。结论 胡桃醌联合顺铂与单药相比能更显著抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，促进其凋亡，两药对肝癌细胞的杀伤效应具有一定的协同作用。

胡桃醌;增殖;顺铂

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康。近年来，联合化疗在肝癌治疗中越来越受到重视。顺铂是目前临床上应用较广的一种高效抗癌药物，但因其有肝、肾、神经等毒性而使其应用受到限制。胡桃醌(Juglone)是从新鲜的胡桃楸根皮、青果皮和枝皮中分离出来的醌类化合物，是胡桃楸中的主要毒性物质[1],它具有强大的抗肿瘤活性，在体外对多种肿瘤细胞具有明显的抑制效果[2-3]，并诱导其凋亡。现如今胡桃醌抗肿瘤的作用机制已不断被现代医学研究揭示，联合应用已经成为抗肿瘤研究的一个重要手段，它能够成为克服单一治疗障碍的有效手段[4]。胡桃醌和顺铂单独用药对肝癌HepG2细胞的抑制作用已经得到证实[5-6]，因而本实验采用联合应用胡桃醌和顺铂以及单独应用胡桃醌和顺铂作用于人肝癌HepG2细胞，探讨联合用药对肝癌HepG2细胞的增殖抑制，为其应用于肿瘤的治疗，减少顺铂的毒副作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HepG2细胞由吉林大学药理教研室赠予；胡桃醌购自Sigma公司；DDP购自山东齐鲁药业公司；酶标仪为BIO-BAD公司的MODEL 550型；LXJ-Ⅱ型离心沉淀机 (上海医用分析仪厂)；H110D电子分析天平(美国Sartorius)。倒置显微镜(上海医用分析仪厂)。

1.2 细胞培养

人肝癌细胞HepG2培养于含10%新生小牛血清的DMEM培养液中培养置于37℃、5%的CO2培养箱中，细胞呈贴壁状态生长，倒置显微镜下观察细胞生长状况并拍照,适量时进行细胞传代。

1.3 MTT比色法测定抑制率

取对数生长期的HepG2细胞，调细胞悬液密度为5×104个/mL,按100 μL/每孔接种于96孔培养板。并用顺铂与完全培养液配制成20、30、40、50 μg/mL不同的浓度，用胡桃醌与完全培养液配制成40、80、120、160、200 μmol/L的不同浓度，设置不加药的对照组和不加MTT的空白对照组，复孔数为3。待细胞贴壁后弃去培养液，给药后培养24 h，期间在倒置显微镜下密切注意观察细胞生长状态并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT 37 ℃孵育4 h，弃去上清后每孔加150 μL二甲基亚砜，在摇床上低速振荡10 min，酶标仪570 nm波长测得吸光度值并记录结果，利用公式计算抑制率：抑制率=[1-(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)]×100%[7]。分别设置空白对照组、顺铂20 μg/mL组、胡桃醌40 μg/L组、联合组(顺铂20 μg/mL+胡桃醌 μg/L)，细胞继续培养24 h后重复上述操作。

1.4 统计分析

对全部数据采用SPSS11.0软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 处理后细胞的形态学变化

胡桃醌与顺铂联合应用后对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用的形态观察见图1。倒置显微镜下可见对照组细胞生长状态良好，单用顺铂、胡桃醌后在显微镜下观察细胞体积缩小，连接消失，与周围细胞脱离，生长状态极差。联合应用顺铂与胡桃醌之后生长状态更差，相比单用药组现象更显著。

2.2 MTT结果比对

不同浓度顺铂处理HepG2细胞24 h后采用MTT法测得各组吸光度，结果表明肝癌细胞的抑制率对顺铂的浓度呈明显剂量相关性，顺铂的浓度分别为20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL。以空白组做对照，测得各组OD值(见图2)。从图中可看出不同浓度顺铂对肝癌HepG2细胞的生长均有抑制作用，各组与对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。

不同浓度胡桃醌处理HepG2细胞24 h后采用MTT法测得各组吸光度，结果表明肝癌细胞的抑制率对胡桃醌的浓度呈明显剂量相关性，胡桃醌的浓度分别为40 μmol/L、80 μmol/L、120 μmol/L、160 μmol/L和200 μmol/L。以空白组做对照，测得各组OD值(见图3)。从图中可看出不同浓度胡桃醌对肝癌HepG2细胞的生长均有抑制作用，各组与对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。

40 μmol/L胡桃醌、20 μg/mL顺铂联合处理细胞24 h之后，采用MTT法测得各组吸光度，从图4中可看出，联合用药相比单药使用可显著抑制HepG2细胞的增殖。各组与对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。

A.对照组;B.Juglone组;C.DDP组;D.联合组

图 2 不同浓度顺铂对HepG2细胞增殖的影响

(和对照组相比:*P<0.05,**P<0.01)

图 3 不同浓度胡桃醌对HepG2细胞增殖的影响

(和对照组相比:*P<0.05,**P<0.01)

图 4 联合作用对HepG2细胞增殖的影响

(和对照组相比:*P<0.05,**P<0.01)

3 讨 论

本实验将低剂量的胡桃醌和顺铂联合作用于体外培养的HepG2细胞，观察到相对于单独使用胡桃醌和顺铂，细胞的生长状态更差，存活的细胞数目减少，MTT结果显示，联合用药比单独用药具有更明显的抑制作用，提示胡桃醌联合顺铂作用于HepG2细胞，起到抑制细胞增殖的作用。具体原因在本实验中并未探明，但李玲[8]在实验中发现Juglone联合顺铂能明显抑制食管癌EC1细胞的增殖，并将细胞周期阻滞在G2/M+S期，这也为本实验提供了一定的佐证，并指明了下一步方向。因此在Juglone联合顺铂诱导肝癌细胞凋亡的过程中，凋亡相关基因的变化及凋亡信号的产生还有待深入研究，以进一步阐述胡桃醌和顺铂联用在HepG2细胞杀伤中协同作用的作用机理。

[1] 万志强，李 薇，崔 久，等.胡桃醌对白血病细胞增殖的抑制作用[J].吉林大学学报:医学版，2012，38(3):486-489.

[2] 欧阳瑾,曹志友,王 爽,等.核桃青皮提取物抑制小鼠Lewis肺癌生长的实验研究[J].时珍国医国药,2009,11(2):232-233.

[3] 陈 丽,那顺巴雅尔,张 建,等.胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞亚显微结构的影响[J].南方医科大学学报,2009,29(6):1208-1211.

[4] 李 清,金英花.抗肿瘤药物联合作用诱导细胞凋亡的研究进展[J].中国生物制品学杂志，2011，24(9)：1112-1115.

[5] 赵行宇，杨 森，周丽霞,等.胡桃醌对肝癌HepG2细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用[J].吉林大学学报:医学版,2013,39(2):255-258.

[6] 周丽霞，杨 森，那文婷,等.顺铂对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的实验研究[J].吉林医药学院学报，2012，33(5)：278-280.

[7] 赵嘉惠，张华屏，王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报，2007，38(3)：262-263.

[8] 李 玲，陈 平，连鸿凯,等.Juglone联合顺铂抑制食管癌细胞EC1细胞增殖的研究[J].山东医药，2010,50(17):72-73.

Effect of juglone combined with cisplatin on the proliferation of liver cancer HepG2 cells

NA Wen-ting1，HAN Jing-chun1，WU Ya-meng1，LI Bo-ya1，CHEN Fei-er1，ZHAO Xing-yu2*

(1.Clinical Medical College,2.Department of Psychology,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Objective To explore the effect of Juglone combined with DDP on the proliferation of HepG2 cells. Methods Different doses of Juglone (DDP) were used to treat HepG2 cells,and optical microscope was used to observe the morphological changes of HepG2 cells,the proliferation inhibition of drugs on HepG2 cells was measured by MTT assay. Results Different doses of drugs lead to the morphological changes of HepG2 cells.MTT assay indicate that Juglone combined with DDP could obviously inhibit the proliferation of HepG2 cells in a dose dependent manner.Juglone combined with DDP could enhance the apoptosis of HepG2 cells. Conclusion Juglone combined with DDP could obviously inhibit the proliferation of HepG2 cells compared with different doses of Juglone or DDP alone,and enhance the apoptosis of HepG2 cells,Juglone and DDP have the synergistic effect on the HepG2 cells apoptosis.

Juglone;proliferation;DDP

1673-2995(2014)01-0023-03

吉林医药学院大学生科研基金项目(2012-01).

那文婷(1990-)，女(汉族)，在读本科.

赵行宇(1970-)，男(汉族),副教授,硕士.

R735.7

A

2013-11-03)