参麦对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的干预作用

何艳芳，郭学芬，王 军

(1. 河南省新乡市中心医院，河南 新乡 453000；2. 河南省辉县妇幼保健院，河南 辉县 453600；3. 徐州医学院第一附属医院，江苏 徐州 221000)

参麦对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的干预作用

何艳芳1，郭学芬2，王 军3

(1. 河南省新乡市中心医院，河南 新乡 453000；2. 河南省辉县妇幼保健院，河南 辉县 453600；3. 徐州医学院第一附属医院，江苏 徐州 221000)

目的 研究参麦注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的干预作用。方法 建立新生鼠HIBD模型。免疫组化方法检测缺氧缺血(HI)后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d各时间点新生大鼠右侧大脑海马CA1区Bax、Bcl-2蛋白表达情况。实验各观察点随机分为假手术组(S组)、参麦注射液治疗组(SM组)、生理盐水对照组(C组)，每组9只。结果 HI后2 h，SM组、C组右侧大脑海马CA1区Bcl-2蛋白表达及Bax蛋白表达均已有升高，24 h达到高峰，14 d各组降到与SM组同一水平:SM组、C组在2 h、12 h、24 h、3 d、7 d点与S组比较均有显著性差异，在14 d与S组比较无显著性差异；SM组在24 h、3 d、7 d与C组比较，Bcl-2蛋白表达较C组高，在2 h、12 h、14 d点与C组比较无显著性差异。SM组在12 h、24 h、3 d、7 d与C组比较，Bax蛋白表达较C组降低，在2 h、14 d与C组比较无显著性差异。结论 参麦注射液可以提高抑制凋亡基因Bcl-2的表达及降低促凋亡基因Bax的表达。

参麦注射液；缺氧缺血性脑损伤；Bax；Bcl-2

本研究旨在探讨参麦注射液对新生大鼠缺氧缺血(HI)后大脑海马CA1区Bax、Bcl-2蛋白的干预作用。

1 实验资料

1.1 动物 7 d龄新生SD大鼠(徐州医学院院实验动物中心提供),雌雄不限,体质量12～16 g。

1.2 主要药品、试剂以及主要仪器 8%O2、92%N2混合气体(上海特种气体厂)，参麦注射液(雅安三九药业有限公司)，常压缺氧舱(上海市儿科研究所)，兔抗Bcl-2抗体、兔抗Bax抗体、SP试剂盒、联苯二胺显示剂(DAB)、枸橼酸钠、磷酸盐缓冲液均购自北京中山公司。

1.3 方法 将新生7 d SD大鼠参照Rice法,乙醚吸入麻醉后,结扎鼠右侧颈总动脉,术毕2 h后置容器中持续吸入8%O2、92%N2混合气体,流速2.0 L/min,以钠石灰吸收CO2,持续2 h，建立HIBD模型。将HIBD模型大鼠随机分为假手术组(S组)、参麦注射液治疗组(SM)组、生理盐水对照组(C组)，各9只。S组仅切开颈正中皮肤和分离右侧颈正中动脉,不结扎,不缺氧。SM组于HI后即刻腹腔注射参麦注射液10 mL/kg,1次/d,在缺氧缺血后7 d内,按观察时间连续用药直至7 d。C组采用生理盐水，用法用量同SM组。免疫组化方法检测缺氧缺血(HI)后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d各时间点新生大鼠右侧大脑海马CA1区Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。将鼠以10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，断头取脑，用4%多聚甲醛固定3 d，石蜡包埋，连续切片，按序间隔留片，并分别贴片后取其中Ⅰ～Ⅱ套留作免疫组化。切片用免疫组织化学染色(SP法)后，LEICA Qwin图像处理与分析系统测定右脑海马CA1区锥体神经元Bcl-2、Bax蛋白表达灰度值。

1.4 检测指标 切片用免疫组织化学染色(SP法)后,LEICA Qwin图像处理与分析系统测定各组新生大鼠右海马CA1区锥体神经元Bcl-2和Bax蛋白表达灰度值。

2 结 果

2.1 HI后各组大鼠海马CA1区Bcl-2表达情况 见表1及图1～6。

2.2 HI后各组大鼠海马CA1区Bax表达情况 见表2及图7～12。

表1 HI后各组大鼠右侧海马Bcl-2灰度值比较

注：①与S组比较,P<0.05;②与S组比较，P<0.01；③与C组比较，P<0.01。

图1 HI后24 h假手术组新生大鼠海马CA1区Bcl-2的表达

图2 HI后24 h对照组新生大鼠海马CA1区Bcl-2的表达

3 讨 论

图3 HI后24 h参麦组新生大鼠海马CA1区Bcl-2的表达

图4 HI后3 d假手术组新生大鼠海马CA1区Bcl-2的表达

图5 HI后3 d对照组新生大鼠海马CA1区Bcl-2的表达

图6 HI后3 d参麦组新生大鼠海马CA1区Bcl-2的表达

组别2h12h24h3d7d14dS组5.53±0.635.32±0.875.09±1.165.40±1.025.39±0.905.4±0.86SM组7.78±1.06①16.72±1.39②③21.86±2.03②④15.3±1.34②④7.54±1.42①③5.6±1.27C组8.0±1.02①16.96±1.40②30.44±1.20②19.22±1.77②9.34±1.30①5.8±1.18

注：①与S组比较,P<0.05;②与S组比较，P<0.01；③与C组比较，P<0.05。

图7 HI后24 h假手术组新生大鼠海马CA1区Bax的表达

图8 HI后24 h对照组新生大鼠海马CA1区Bax的表达

图9 HI后24 h参麦组新生大鼠海马CA1区Bax的表达

图10 HI后3 d假手术组新生大鼠海马CA1区Bax的表达

图11 HI后3 d对照组新生大鼠海马CA1区Bax的表达

图12 HI后3 d参麦组新生大鼠海马CA1区Bax的表达

段涛等[1]研究表明，新生儿缺氧缺血性脑损伤后迟发性神经元死亡的发生与细胞凋亡密切相关,其机制极为复杂,可能涉及线粒体损伤导致的能量代谢障碍、氧自由基、损伤、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸及其受体毒性、体液因子、炎症细胞和炎症因子、细胞因子损伤等各个方面。参麦注射液组方源于《千金要方》之生脉散，是根据祖国传统医学的经典方剂修正而成的复方制剂，已广泛用于临床。参麦注射液的有效成分是人参皂甙和人参多糖,具有清除氧自由基、抗脂质过氧化、保护内皮细胞作用,可扩张外周血管,增加冠脉血流量,提高心肌对缺氧、缺血的耐受性,减轻心肌缺血,缩小心肌梗死范围,保护、修复心肌细胞[2]。俞锐敏等[3]

证实了不同剂量参麦注射液对机体的作用。结合预实验及参麦注射液药理研究结果，本实验选用10mL/kg这一剂量。在细胞凋亡调控机制方面，Bcl-2家族是迄今为止研究得最深入，广泛的凋亡调控基因之一[4]。Bcl-2作为一种广义的抑制凋亡基因,其功能主要是抑制细胞凋亡，促进细胞生存，它通过羧基端的信号锚定序列跨线粒体膜而发挥作用,在线粒体上可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性,以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡[5]。Bax基因亦为Bcl-2家族成员,结构与Bcl-2有21%的相似性,其作用则与Bcl-2相反,活化的Bax可使线粒体和脂质体通透性增加,启动凋亡信号,具有促凋亡作用。而Bcl-2可抑制Bax的活化,从而抑制细胞凋亡。本实验结果显示：与生理盐水对照组相比，参麦治疗组大鼠海马神经元CA1区Bcl-2蛋白表达细胞数明显增加，Bax蛋白表达细胞显著减少，表明参麦注射液可能通过调节Bcl-2、Bax蛋白的表达抑制神经凋亡。

[1] 段涛,陈超. 新生儿缺氧缺血性脑病(Ⅱ)[J]. 中华医学杂志,2005,8(5):129-133

[2] 欧阳修河，尹睿，张颖. 参麦注射液对无创通气治疗慢性阻塞性肺病并严重呼吸衰竭的影响[J]. 中国中西医结合杂志，2006，26(7)：608-611

[3] 俞锐敏，熊爱华，杨钦河. 参麦注射液对大鼠急性心肌缺血及eNOSmRNA表达的影响[J]. 中国病理生理杂志，2006，22(6)：1083-1086

[4] 周斌，于博，姚南，等. 三七总皂甙对梗阻性黄疸肝组织中Bax，Bcl-2表达的影响及意义[J]. 第四军医大学学报，2006，27(19)：1765-1770

[5] 王汉民,吴雄飞,谭华等. 川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响[J]. 第四军医大学学报,2006，27(20)：1884-1889

Effects of Shenmai injection on hypoxic-ischemic brain damage of neonatal rats

He Yanfang1, Guo Xuefeng2, Wang Jun3

(1.The Central Hospital of Xinxiang, Xinxiang 453000, Henan, China; 2.Matern and Child Health Care Hospital of Huixian County, Huixian, Henan, China 453600; 3.The First Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu, China 221000)

Objective It is to investigate the intervention effect of Shenmai injection on neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage. Methods Neonatal rat models with HIBD were established. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region of right brain in neonatal rats with HIBD at 2 h, 12 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d after hypoxic-ischemic (HI) insult. Every observed spot was separated into three groups: sham operation (S), control group (C) and Shenmai injection treatment (SM). Results The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM, group C at 2 h after HI insults had already began to increase, peak at 24 h and then gradually decreased. The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in every group had no difference at 14 d (P>0.05). The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM at 24 h, 3 d， 7 d was significantly more than that of group C(P<0.05,P<0.01). The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM and group C had no difference at 2 h, 12 h, 14 d (P>0.05). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM, group C at 2 h after HI insults had already began to increase, peak at 24 h and then gradually decreased. The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in every group had no difference at 14 d (P>0.05). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM at 12 h, 24 h, 3 d, 7 d was significantly less than that of group C(P<0.05,P<0.01). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM and group C had no difference at 2 h, 14 d(P>0.05). Conclusion Shenmai injection can significantly enhance the expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region and decline the expression of Bax in right hippocampal CA1 region.

Shenmai injection; hypoxic-ischemia brain damage; Bax; Bcl-2

何艳芳，女，主治医师，硕士，主要从事新生儿疾病的诊治工作。

王军，Tel：18052268109

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.05.007

R-332

A

1008-8849(2014)05-0475-04

2013-05-10