冬凌草甲素对人肺癌NCI-H460细胞侵袭和迁移的影响*

柳悄然， 张在云， 于晓明， 潘祥林， 王涓冬， 刘军莉

(1山东大学医学院，山东 济南 250012；山东大学第二医院 2肿瘤防治中心， 3临床分子实验室，山东 济南 250033)

肺癌严重危害人类健康，发病率及死亡率高，目前的治疗方法副作用大，效果不理想，需要探索高效低毒的药物。冬凌草甲素是从冬凌草中提取的一种四环二萜类化合物，具有抗炎、抗菌、降压、抗肿瘤等多种药理作用[1-2]。研究显示，冬凌草甲素通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成等多种机制发挥抗肿瘤作用[3]，但关于冬凌草甲素对肺癌细胞的侵袭和迁移的作用研究较少，本文就此进行研究，以进一步揭示冬凌草甲素抗肿瘤作用机制，为肺癌治疗探索有效的方法。

材 料 和 方 法

1 仪器及材料

CO2培养箱(Format)；恒温离心机(Heraeus)；酶标仪(Bio-Rad)，垂直电泳装置(Bio-Rad)。NCI-H460细胞购自中国科学院细胞研究所；冬凌草甲素购自上海诗丹德生物技术有限公司(纯度≥98%)；RPMI-1640购自Gibco；MTT及二甲基亚砜购自Sigma；兔抗鼠IgG抗体、鼠抗人β-actin、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9抗体购自Santa Cruz；细胞培养板购自Corning；Boyden Chamber购自Millipore；Western-blot Luminol(ECL)试剂盒购自Santa Cruz。

2 方法

2.1NCI-H460细胞的生长观察 NCI-H460肺癌细胞株在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。胰酶消化，将细胞接种于12孔培养板，每孔1×105细胞，分为高剂量(high-dose,HD)组、中剂量(middle-dose,MD)组、低剂量(low-dose,LD)组和对照(normal,N)组，前3组为实验组，分别用含40、20和10 μmol/L冬凌草甲素的RPMI-1640细胞液培养，N组用不含冬凌草甲素的RPMI-1640液培养，连续培养7 d。每24 h每组取3孔细胞，用胰酶消化，用0.2%台盼蓝染色，以血球计数板计数，实验重复3次，以每组细胞数的平均值绘制生长曲线。

2.2NCI-H460细胞增殖检测 将4组NCI-H460细胞用胰酶消化，稀释细胞为1×107/L，接种于96孔培养板，每组3复孔，每孔1×103细胞，终体积200 μL，37 ℃培养24 h、48 h及72 h后，加入MTT 100 μg/well，培养4 h，离心，弃上清，加入DMSO振荡10 min，用酶标仪于570 nm测吸光度(A)。重复实验3次。计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

2.3NCI-H460细胞的侵袭实验 将4组NCI-H460细胞干预培养24 h，胰酶消化，制成单细胞悬液，进行Boyden chamber侵袭试验，检测细胞的侵袭能力。下室加含10%胎牛血清的培养基，上室内接种2×105细胞，每组设3个复孔。培养72 h后计数穿透滤膜的细胞数，表示肿瘤细胞的侵袭能力。倒置显微镜下每孔随机选择5个200倍显微镜视野，统计视野中的细胞总数，计算3复孔的平均值，实验重复3次。

2.4划痕实验检测NCI-H460细胞的迁移能力 将4组处于对数生长期的NCI-H460细胞用胰酶消化，用PBS洗2遍，重悬细胞，稀释细胞浓度为2×108/L，按每孔1 mL接种于24孔细胞培养板，每组6复孔，接种后24 h，用200 μL移液枪头在培养板底部做“一”字形划痕，沿划痕边缘等间距做3个标记作为观察点，用PBS洗去划落的细胞，继续培养48 h，倒置显微镜下测量细胞迁移的距离，计算细胞迁移的平均速率。计数每孔划痕处3个视野的迁移细胞数，进行统计分析。

2.5Western blotting检测MMP-2和MMP-9的表达 用胰酶消化收集4组细胞，将每组细胞1×106个裂解，提取蛋白,并测定蛋白浓度；进行SDS-PAGE，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1 h，加入鼠抗人β-actin、MMP-2和MMP-9抗体，再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体，进行ECL反应显影并曝光，在Bio-Rad凝胶成像仪中观察，实验重复3次。用Quality One软件分析条带相对A值(靶蛋白A/β-actinA)，比较蛋白表达水平。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0软件分析。多组资料间的比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NCI-H460细胞生长情况

倒置显微镜下观察细胞外形，与N组比较，用冬凌草甲素干预的NCI-H460细胞变圆，贴壁延缓，伸展差，悬浮细胞增多，细胞密度降低，HD组变化更明显。细胞计数显示，4组细胞数量间有显著差异，HD组

Figure 1. Growth curves of NCI-H460 lung cancer cells cultured with 40, 20 and 10 μmol/L of oridonin (HD, MD and LD groups), or without oridonin (N group). Mean±SD. n=3.

2 MTT方法检测NCI-H460细胞增殖

4组细胞在48 h(P<0.01)及72 h(P<0.01)时测定A值均有显著差异，与N组相比，实验组A值均降低，HD组

Figure 2. The cell proliferation in experimental groups (HD, MD and LD) and N group was determined by MTT assay.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs experimental groups.

3 NCI-H460细胞的侵袭能力

细胞体外侵袭实验显示，4组细胞穿透滤膜的细胞数均有显著差异(P<0.01)，与N组(53.67±6.68)相比，HD组(26.67±5.16)、MD组(36.17±5.08)和LD组(44.33±5.50)穿透细胞数明显减少，表明经冬凌草甲素处理的NCI-H460细胞侵袭能力减弱。

4 NCI-H460细胞的迁移能力

将4组NCI-H460细胞做划痕实验，计算细胞迁移的平均速率及迁移细胞数。结果4组细胞的平均迁移速率(P<0.01)及迁移细胞数(P<0.01)有显著差异，见表1，N组均高于实验组，在实验组中，HD组平均迁移速率及迁移细胞数最低。

表1 NCI-H460细胞的迁移能力

5 Western blotting方法检测NCI-H460细胞的MMP-2和MMP-9的表达

结果显示，4组细胞均有MMP-2及MMP-9蛋白表达；以靶蛋白A/β-actinA的比值代表蛋白相对表达水平，N组表达MMP-2(1.16±0.26)及MMP-9(0.90±0.14)均高于实验组(P<0.01)，HD组表达MMP-2(0.29±0.09)及MMP-9(0.31±0.06)水平最低，HD组

讨 论

肺癌的发病率和死亡率在全世界范围内持续升高，已成为恶性肿瘤死因的第一位，而大部分肺癌患者死于肿瘤的复发和转移，探索有效的抑制肿瘤侵袭转移的药物具有重要意义。

冬凌草甲素是从唇形科香茶菜属植物冬凌草中提取的二萜类化合物，具有明显的抗肿瘤作用，是中草药冬凌草抗肿瘤的主要活性成分，对胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌和结直肠癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用[4-6]。体外研究显示，冬凌草甲素可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶、表皮生长因子受体等相关信号通路防止肿瘤发生，增强吞噬细胞吞噬作用等[7-8]，冬凌草甲素还可阻遏细胞周期、下调端粒酶活性、抑制细胞膜钠泵活性、逆转多药耐药等[9-11]。关于冬凌草甲素对肺癌细胞作用，研究显示它能抑制SPC-A-1细胞增殖，诱导SPC-A-1细胞凋亡，增强A549肺癌细胞的自吞噬作用[12]。但关于冬凌草甲素对肺癌细胞的侵袭和迁移能力的影响鲜有报道。

Figure 3. The protein expression of MMP-2 and MMP-9 was determined by Western blotting. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs other groups.

在本项目中，用冬凌草甲素干预处理NCI-H460细胞，进行体外增殖、侵袭、迁移能力观察，结果经冬凌草甲素干预处理的细胞生长减慢，实验组细胞数量明显低于N组，且与冬凌草甲素剂量明显相关，HD组

侵袭和转移是肿瘤恶性程度的重要标志，也是导致肺癌患者死亡的主要原因。细胞外基质是恶性肿瘤侵袭、转移的重要组织屏障，MMP能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，在恶性肿瘤的侵袭转移中发挥关键作用。其中MMP-2和MMP-9是最主要的Ⅳ型胶原酶，已证实MMP-2和MMP-9在多种肿瘤中表达，并与肿瘤细胞的侵袭、转移能力密切相关，抑制MMP-2和MMP-9的表达及活性，能抑制肿瘤的侵袭、转移[13]。在本实验中，经冬凌草甲素干预处理的NCI-H460肺癌细胞MMP-2和MMP-9表达下调，且与冬凌草甲素剂量相关，HD组最明显，与NCI-H460细胞的侵袭、迁移实验结果一致，表明冬凌草甲素可通过下调MMP-2和MMP-9抑制NCI-H460肺癌细胞的侵袭、迁移。

本课题通过体外研究，表明冬凌草甲素能抑制NCI-H460肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，并抑制NCI-H460肺癌细胞表达MMP-2和MMP-9，为冬凌草甲素用于肺癌治疗奠定了基础。

[参 考 文 献]

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