丙戊酸孤独症大鼠脑中经典Wnt信号通路的变化*

张应花， 邓晓慧， 王中平， 崔卫刚,， 文小军， 李瑞锡

(1新乡医学院解剖教研室，河南 新乡 453003； 2复旦大学上海医学院人体解剖与组织胚胎学系，上海 200032；3九江学院基础医学院生理学与病理生理学教研室，江西 九江 332000)

孤独症是一种广泛的神经发育障碍性疾病，临床上患儿有以下三大核心特征：语言发育延迟、社交行为障碍、重复呆板样行为[1]，严重影响了患儿的语言形成、社交行为及情绪认知。然后，孤独症的病因还是一个谜。孤独症病因不明，目前普遍认为是遗传和环境因素在脑发育关键时期共同作用的结果。非遗传因素可能与干扰胚胎脑发育的正常信号转导通路有关，而遗传因素可能是信号转导通路异常导致的基因突变所致。

经典Wnt通路又称为 Wnt/β-catenin 通路, 其主要成员有Wnt、Frizzled 受体、Dvl/Dsh、糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、Axin、APC、β-catenin及TCF/LEF等等，其中β-catenin是关键分子。在存在Wnt 配体的情况下，Dvl抑制 APC、Axin和GSK3β等组成的破坏复合体。抑制破坏复合体导致β-catenin在胞浆中聚集，β-catenin 越聚越多，随后移位至胞核。在细胞核内，β-catenin 与 TCF/LEF转录激活因子结合，激活Wnt下游靶基因cyclin D1、c-myc等的转录。在没有Wnt信号情况下，GSK-3β磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin被蛋白酶体降解，从而使细胞内游离的β-catenin保持在极低的水平，这时TCF/LEF转录因子在细胞核内与转录抑制因子结合，从而抑制Wnt靶基因的表达[2]。

经典Wnt信号通路调控细胞的增殖、迁移、分化、细胞的凋亡、突触的形成与联系，调控细胞、组织及器官正常有序的分化和生长发育。经典Wnt信号通路在个体发育尤其是神经发育过程中起着至关重要的的作用。然而Wnt通路作用犹如双刃剑，既是调控神经细胞正常分化发育的重要通路，又是神经发育疾病发生的成因之一，通路中任何蛋白分子表达异常，都将引起信号传递错误，导致细胞命运的改变，进而引发神经发育障碍疾病的发生，如孤独症。

Wnt信号转导异常导致孤独症患者脑形态和功能异常。如β-catenin过度表达，能使神经前体细胞增殖，可能与孤独症脑早期的过度增生有关，而β-catenin的失活会导致脑发育畸形和颅面发育不全。此外，研究发现，孤独症模型鼠存在β-catenin及其靶基因表达上调[3]，而且 β-catenin时空表达存在明显异常。经典Wnt信号通路一个基因的突变，如Wnt1，增加下游信号通路的激活可能会导致神经发育及行为学表现异常。最近研究结果显示，Wnt1反义突变导致Wnt信号通路激活，可能增加了孤独症的易感性[4]。这些研究强烈提示Wnt通路与孤独症的发病密切相关。故研究该信号通路及其通路中蛋白基因与孤独症的发病关系，对揭示孤独症的分子病因和发病机制，具有重要的理论和实践意义。

丙戊酸(valproic acid，VPA)具有抑制γ-氨基丁酸转氨酶活性而增强突触内γ-氨基丁酸能神经传递的作用，是临床用于治疗癫痫、双向情感障碍及偏头痛的常规药物。然而，近10年来流行病学研究发现，孕妇在怀孕早期服用 VPA，大大增加了子代患孤独症的风险。通过在怀孕早期运用 VPA 处理孕鼠，能较好地在子代幼鼠上复制出类似孤独症患者表现出的某些症状，也在子代幼鼠脑区检测出一些类似的组织结构及生化异常。VPA动物模型是目前公认的较成熟的孤独症动物模型[5]。为此，本实验拟用VPA孤独症动物模型研究经典Wnt信号通路活性变化，以揭示孤独症发生的可能机制，为孤独症的分子病因提供有力的实验数据和理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1主要材料和试剂 VPA购自Sigma；兔抗GSK-3β、phospho-GSK-3β和phospho-β-catenin抗体购于Cell Signaling Technology；兔抗β-catenin抗体购于Santa Cruz；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购于康成公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG购于Jackson；Western Ⅰ抗稀释液、蛋白裂解缓冲液、蛋白浓度测定BCA试剂盒购于碧云天；cDNA逆转录试剂盒购自TaKaRa，2×PCR mix购自Invitrogen，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.2动物 健康成年雄性(300～350 g)及雌性(200～250 g) Wistar大鼠，购自中国科学院(上海)实验动物部，饲养于复旦大学人体解剖与组织胚胎学系专用动物房，给予充分的饲料和饮水。所有实验动物喂养及实验程序均严格遵照复旦大学实验动物保护条款。

2 方法

2.1孤独症大鼠模型建立 Wistar大鼠在周期性光照(7:00 AM～7:00 PM)、恒温 25 ℃和恒湿 55%条件下饲养数天，使之适应环境。然后，按雌∶雄 2∶1合笼过夜。第2天早晨，检查到阴栓的雌鼠记为E1 d， 然后分笼单独饲养。参照Schneider等[6]使用的方法，将受孕母鼠随机分成2组：模型组在 E12.5 d时给予母鼠600 mg/kg VPA (ip)，VPA粉末用0.85%生理盐水(normal saline，NS)配成 250 g/L的溶液。对照组母鼠给予同等量的 NS (ip)。模型组母鼠产下的仔鼠记为VPA 孤独症模型鼠(VPA组)；对照组母鼠产下的仔鼠记为正常对照组(control组)。仔鼠在出生后23 d (postnatal day 23, PND23)断乳。VPA 组仔鼠和control 组仔鼠分别取 8只进行后续实验研究。

2.2孤独症模型动物生长发育和行为学检测 为观察PND7～10幼鼠的方向趋向性机能，分别取6只 VPA组及control组子代鼠，将幼鼠头朝下放置在 25°光滑倾斜平面上，观察幼鼠转动180°的活动情况，记录比较VPA组及control组子代鼠完成转动所花费的时间平均值。这项实验反映了幼鼠方向感觉及运动机能等的总体发育水平。PND23的幼鼠进行热平板实验，幼鼠测试前适应环境30 min。使用GJ-8402型热板测痛仪致痛，准确调节热板温度在(55.0±0.5)℃，并用水银温度计校对。以放入幼鼠开始计时，至鼠翘起后足或舔后足为止，所经历的时间作为痛反应的指标，此时间即为痛阈值。22 s为最大刺痛阈值，以避免对组织造成损伤。每只动物重复 3 次，间隔时间为 15 min。每次由不同的检测者进行测试，记录比较VPA组及control组子代鼠平均痛阈值。

2.3Western blotting检测经典Wnt信号通路信号分子蛋白水平的表达 用蛋白裂解液提取大鼠前额叶皮质与海马脑组织总蛋白质，用BCA法测定样品的蛋白浓度。加入5×loading buffer后，100 ℃加热变性3 min。进行12%SDS-PAGE，将蛋白质转移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白TBST摇床常温封闭2 h。加Ⅰ抗，4 ℃摇床过夜；加Ⅱ抗和GAPDH摇床常温1 h，化学发光试剂显色，然后将PVDF膜置于Bio-Rad的显影机上，获取反应条带的数字图并将条带进行灰度测定，以目的蛋白和内参照GAPDH蛋白的灰度比值代表目的蛋白的相对表达量。

2.4半定量RT-PCR检测经典Wnt信号通路信号分子mRNA水平的表达 用Trizol提取大鼠前额叶皮质与海马脑组织总RNA。A260/A280比值在1.8～2.0之间。根据GenBank提供的基因序列使用Primer Design软件进行引物设计。引物序列参照表1。RT-PCR按照说明书进行操作,反应条件为：95 ℃ 5 min变性，然后95 ℃，30 s,57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,扩增30个循环，最后72 ℃ 延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖(溶于1×TBE)凝胶电泳分离，在Runone DNA电泳系统中进行，用数字成像系统分析图像，以目的基因灰度与内参照基因灰度比值代表目的基因的相对表达量。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0 统计软件处理，两组间比较用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 孤独症模型动物生长发育及行为学检测比较

当把大鼠头朝下放置在倾斜平面时，大鼠有自动转身 180°而头保持朝上的本能。转身过程所用时间的长短反映了大鼠前庭感觉及运动机能的发育情况。在检测的各年龄段，孤独症模型组仔鼠转身所用时间较对照组显著增加，见图1A，表明VPA处理对子代鼠的前庭感觉及活动造成不利影响。热平板实验结果显示，孤独症模型组痛阈值比正常对照组明显增加，两者差异有统计学意义，见图1B，说明孤独症模型组痛觉明显比对照组迟钝，逃避伤害性刺激动作迟缓，对伤害性知觉不敏感。以这些模型动物为实验对象，做后续实验是可靠的。

表1 半定量RT-PCR引物序列

Figure 1. Geotaxis and thermal hyperalgesia in autistic and control rats. A: geotaxis; B: pain threshold. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2 孤独症大鼠经典Wnt信号通路GSK-3β及β-catenin mRNA表达变化

半定量RT-PCR结果显示，孤独症模型组GSK-3β mRNA表达低于正常对照组，差异有统计学意义，见图2A，而β-catenin mRNA表达高于正常对照组，差异有统计学意义，见图2B。

Figure 2. Expression of GSK-3β (A) and β-catenin (B) mRNA in prefrontal cortex (PFC) and hippocampus formation (HF) of control and autism rats. Mean ±SD.n=8.*P<0.05 vs control.

3 孤独症大鼠经典Wnt信号通路GSK-3β及β-catenin 蛋白及磷酸化表达变化

Western blotting结果显示，孤独症模型组GSK-3β磷酸化表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义，见图3A，而β-catenin 磷酸化表达明显低于正常对照组，差异有统计学意义，见图3B。

Figure 3. Expression of GSK-3β (A) and β-catenin (B) proteins in PFC and HF of control and autism rats. p-GSK-3β：phosphorylated GSK-3β (Ser 9); T-GSK-3β: total GSK-3β; p-β-catenin: phosphorylated β-catenin (ser33/37/Thr41); T-β-catenin: total β-catenin. Mean±SD. n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

4 孤独症大鼠经典Wnt信号通路下游c-Myc及cyclin D1 mRNA表达变化

半定量RT-PCR结果显示，孤独症模型组c-Myc及cyclin D1 mRNA表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义，见图4。

Figure 4. Expression of c-Myc (A) and cyclin D1 (B) mRNA in PFC and HF of control and autism rats.Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

讨 论

为探讨经典Wnt信号通路在孤独症发病中的作用，本实验检测了孤独症模型大鼠PFC和HF脑区内经典Wnt信号通路的活性变化。结果显示，与正常对照组相比，孤独症模型大鼠脑内经典Wnt通路的活性增强，基于GSK-3β mRNA减少，失活的GSK-3β磷酸化表达增加；β-catenin mRNA增加，抑制性的β-catenin磷酸化减少；下游c-Myc和cyclin D1 mRNA增加。这些结果提示经典Wnt信号通路活性增加可能是孤独症发病的原因之一，其活性增强可能促进对孤独症的易感性。

研究显示，影响个体发育的环境危险因素与孤独症发病之间存在关联。妊娠早期即在神经管闭合时期VPA暴露大大增加子代罹患孤独症的风险。孤独症在个体发育早期表现为脑过度增长，这可能与参与胚胎发育调控的 Wnt 信号通路传导障碍有关[5]。

经典Wnt 信号通路调控中枢神经系统细胞增殖、分化、迁移、凋亡、突触的形成与联系及胚胎的发育，参与孤独症的发生[3, 7]。但是，迄今为止，经典的 Wnt信号通路如何参与孤独症发生的分子机制并不完全清楚。我们课题组以前研究结果显示，VPA 暴露上调Wnt1 和 Wnt2表达，增加下游靶基因engrailed-1和 cyclin D1表达[3]。这可能与Wnt1和 Wnt2 表达增加激活经典Wnt信号通路，导致下游信号分子β-catenin表达增加，从而激活 Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录有关。

本实验结果发现，VPA 暴露显著减少抑制性的β-catenin(Ser33/37/Thr41)磷酸化水平，增加失活的GSK-3β(Ser9)磷酸化水平，导致经典Wnt 信号通路活性增加。GSK-3β是β-catenin上游的负性调节因子，参与磷酸化β-catenin，与β-catenin胞浆降解紧密相关， 故在孤独症发病机理中起着至关重要的作用[8]。GSK-3β受N 末端丝氨酸(Ser9)负性调节，磷酸化Ser9 则GSK-3β失活；相反，磷酸化其酪氨酸(Tyr216)则GSK-3β活性增加[9]。我们实验结果表明，VPA暴露增加了失活的GSK-3β(Ser9)磷酸化，表现在 GSK-3β底物β-catenin表达增加，β-catenin 磷酸化减少。这一结果与以前的报道结果是一致的，即孤独症的发生与GSK-3β活性增强有关[8]。显然，GSK-3β(Ser9)磷酸化增加、β-catenin(Ser33/37/Thr41)磷酸化减少表明经典Wnt信号通路活性增加，暗示经典Wnt信号通路参与孤独症的发生。我们前期结果显示，经典Wnt信号通路特异性抑制剂舒林酸处理以后，伤害性知觉、重复刻板样、学习记忆能力等孤独症样行为均有所改善[5]，该结果进一步证实了我们的推断，即Wnt/β-catenin信号通路活性增加促进了对孤独症的易感性。

综上所述，我们认为，VPA暴露通过诱导脑组织Wnt/β-catenin通路活性增加，使脑内经典Wnt信号通路功能增强，可能影响神经元正常发育和联系，阻碍了正常的神经网络形成，从而可能引起社会交往、情绪和语言等行为方面的异常，最终导致孤独症的发病。

[参 考 文 献]

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