免疫抑制剂FK506所致血糖升高副作用的机制研究*

张 玲， 孙 萌， 史 波， 唐丽丽， 吴存造， 蔡 勇， 夏 鹏， 郑少玲， 杨亦荣， 陈必成

(温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000)

移植术后糖尿病(post-transplantation diabetes mellitus，PTDM)是实体脏器移植后常见的并发症之一，严重影响移植受者的长期生存率及移植脏器的存活率。据报道，PTDM的发病率因移植脏器的不同而有所差别，范围波动在4%～50%[1]。大量研究表明[2]，免疫调节剂钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor, CaNI)的大量运用是PTDM的重要危险因素之一。临床常用的CaNI以FK506和环孢霉素A(cyclosporin A, CsA)为主， 且FK506比CsA更易诱导PTDM[3]。目前，多数基础研究主要关注FK506对胰岛细胞的损伤及胰岛素分泌的影响。也有研究表明[4-5]，使用CaNI的移植术后患者早期血胰岛素水平普遍会高于正常组。FK506作为胰岛移植术后最常用的免疫抑制剂之一,其诱导PTDM的机制存在矛盾之处。本研究通过建立动物模型，尝试阐述FK506对大鼠脂肪因子分泌谱及其关键信号通路PPAR-γ的影响，以进一步揭示FK506诱导糖耐量损伤的机制。

材 料 和 方 法

1 材料及设备

FK506(国药准字J20090142)购于安斯泰来制药(中国)有限公司；生理盐水购于上海丽臣生物科技有限公司；水合氯醛购于上海京索来宝生物科技有限公司；血糖仪及血糖试纸购于长沙三诺生物传感股份有限公司；Trizol试剂购于Gibco；逆转录试剂盒和SYBR Green I荧光定量试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；实时荧光定量PCR所用引物由上海生工生物技术有限公司合成(引物序列见表1)；PPAR-γ、adiponectin、GAPDH兔抗大鼠Ⅰ抗以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG Ⅱ抗购于Abcam；所用荧光定量PCR仪ABI7500购于ABI。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 动物分组与模型制备

雄性SD大鼠12只，9周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2012-0001，初始体重为(188.65±12.71)g，血糖(4.86±0.44)mmol/L。动物饲养环境：温度(22±2) ℃，保持通风，自然昼夜节律变化，相对湿度40%～60%。给予动物标准饲料，1只1笼喂养。

大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组(每组6只)。给药组大鼠给予腹腔注射1 mg·kg-1·d-1FK506 (1 mg溶于2 mL生理盐水)；对照组大鼠给予腹腔注射1 mL·kg-1·d-1生理盐水。在禁食不禁水8 h后，每天测空腹体重1次。用药后，用大鼠固定器固定大鼠，断尾取血，每2 d测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。

3 标本的留取与保存

给药第15天，禁食8 h后，给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/kg)，固定，消毒。经下腔静脉放血后，取大鼠腹腔内脏脂肪及附睾脂肪组织，以预冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水份后放入冻存管，迅速转入液氮降温，-80 ℃长期保存。

4 实时荧光定量PCR方法检测靶基因表达情况

用 Trizol试剂盒提取给药组和对照组大鼠脂肪组织的总RNA。参照逆转录试剂盒说明书，吸取2 μg RNA样本在10 μL体系中进行逆转录反应。取逆转录产物1 μL进行PCR扩增, PCR扩增体系为：5 μL荧光定量染料2×SYBR荧光定量试剂、2 μL引物(上、下游各1 μL)、2 μL Plus反应液、1 μL cDNA。检测靶基因包括: 氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ)、脂联素 (adiponectin)、抵抗素 (resistin)、瘦素 (leptin)、内酯素 (visfatin)、视黄醇结合蛋白4 (retinol-binding protein 4, RBP4)。扩增程序为：95 ℃ 3 min后，进行95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40个循环扩增。得到的Ct值用2-ΔΔCt法计算mRNA表达的变化(结果为倍数关系)。

5 Western blotting法检测靶蛋白表达情况

裂解液(RIPA)提取给药组与对照组大鼠脂肪组织蛋白。冻融后的脂肪组织100 mg在冰上剪碎，加入1 mL 含1% PMSF的裂解液，作用60 min后吸取提取液； 12 000 r/min 离心30 min，取上清液测蛋白浓度；制备10%聚丙烯酰胺分离胶和5%浓缩胶，样品5×SDS上样缓冲液, 设置恒压100 V, 电泳60 min；设置恒流350 mA，湿法电转移(脂联素30 min，PPAR-γ 55 min)， 转膜后的PVDF膜经5% TBST脱脂奶粉室温封闭2 h；然后加Ⅰ抗(稀释在Ⅰ抗稀释液中)，4 ℃孵育过夜，加入相应种属Ⅱ抗，室温孵育1.5 h，ECL发光液孵育膜5 min，暗室压片曝光，显影定影后胶片保存。

6 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 采用Microsoft Excel 2003统计软件进行单因素方差分析和IBM SPSS Statistics 19统计软件进行重复测量设计的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况及大鼠体重的变化

在观察时间内，大鼠活动正常，各组大鼠未出现死亡现象。2组大鼠在实验过程中体重缓慢增加，第14天后2组大鼠体重无显著差异(P>0.05)，见图1。可排除体重对实验结果的影响。

Figure 1. The changes of body weight in the rats fasted for 8 h.Mean±SD.n=6.

2 2组大鼠FBG变化

在实验期间前10 d内，2组大鼠FBG值无明显差异，见图2。在第10天后，给药组大鼠FBG趋势发生变化，第12天的空腹血糖首次大于7 mmol/L。第13天、第15天连续监测FBG，给药组大鼠持续≥7 mmol/L，而对照组大鼠血糖始终<6.5 mmol/L。给药组大鼠FBG显著高于对照组(P<0.05)。对照组大鼠FBG无显著变化(P>0.05)。

3 2组大鼠脂肪组织PPAR-γ mRNA的表达

2组大鼠脂肪组织PPAR-γ mRNA的表达差异显著(P<0.05)。给药组大鼠PPAR-γ mRNA的表达量明显低于对照组(P<0.05),见图3。

Figure 2. The changes of fasting blood glucose in adult rats observed for 2 weeks.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal.

Figure 3. The mRNA expression of PPAR-γ in adipose tissues of the rats treated with FK506 or saline (normal).Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal.

4 2组大鼠脂肪因子mRNA表达的变化

与对照组相比，给药组大鼠脂联素的表达下降到20%，瘦素的表达下降到60%，差异显著(P<0.05)；而内酯素、抵抗素及RBP4的表达相对升高，分别升高至对照组的3倍、2倍及1.6倍(P<0.05),见图4。

5 2组大鼠脂肪组织PPAR-γ及脂联素蛋白的表达变化

2组大鼠脂肪组织PPAR-γ及脂联素蛋白表达差异显著。与对照组相比，给药组大鼠PPAR-γ蛋白的表达量下降到40%，脂联素下降到19%(P<0.05),见图5、6。

讨 论

FK506是目前在临床运用最为广泛的CaNI免疫抑制剂，主要通过calcineurin/NFAT通路，抑制T细胞的免疫应答。目前，多数研究认为，PTDM发生机制主要是FK506在抑制免疫反应的同时，也通过calcineurin/NFAT通路作用于胰岛β细胞，抑制胰岛素的分泌[6]。也有体外研究表明，FK506可以作用于脂肪细胞，参与下调PPAR-γ的表达[7]。本研究表明，与对照组相比，给予FK506的大鼠FBG明显升高；内脏脂肪组织的PPAR-γ、脂联素及瘦素mRNA的表达量降低，内酯素、抵抗素及RBP4 mRNA的表达量升高。通过本实验证实，FK506能够调节脂肪组织中PPAR-γ及脂肪因子的表达。

Figure 4. The mRNA expression of adipocytokines in the rats fasted for 8 h and treated with FK506 or saline.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

Figure 5. The expression of PPAR-γ detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

Figure 6. The expression of adiponectin detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal.

早在2007年，Hernandez-Fisac等[8]用一定剂量的FK506成功建立PTDM大鼠模型，来研究FK506对胰岛素基因表达的影响。本实验以此为参考，在排除大鼠体重对实验的干扰下，得到的FK506大鼠FBG明显高于对照组。这充分说明，FK506是影响大鼠空腹血糖变化及胰岛素对血糖变化调节能力的独立因素。FK506对血糖的影响，不仅仅是因为抑制胰岛素的分泌，也有可能是诱导了胰岛素抵抗。有研究证实[5]胰岛素抵抗存在于PTDM患者血糖升高之前，并贯穿全过程。所以，胰岛素抵抗可能是PTDM的始发因素。因为，胰岛素抵抗容易引起胰岛素的积聚，高浓度的胰岛素会降低胰腺β细胞对血糖的敏感性，引起血糖升高。而高血糖会抑制胰腺细胞的增殖，导致胰岛素分泌不足，最终共同引起血糖的升高。所以，FK506可能首先影响的是胰岛素对血糖的调节能力，最终导致血糖变化。

目前，PPAR-γ在脂肪组织的胰岛素抵抗方面起到了重要作用。研究表明[9]，PPAR-γ主要与调节脂肪组织脂肪因子分泌有关。脂肪因子是脂肪组织分泌的一类细胞因子，可以直接作用于胰岛素信号通路，调节血糖水平，可以改善胰岛素抵抗。脂肪因子主要包括：脂联素、瘦素、抵抗素、内酯素和RBP4等。其中，脂联素具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖摄取量、改善胰岛素抵抗和抗炎的作用，具有胰岛素增敏作用。人体实验证明[10]脂联素与机体胰岛素敏感性之间有很强的相关性。瘦素可以抑制下丘脑的进食中枢，减少食物的摄取量，促进能量的消耗。但是，抵抗素、内酯素及RBP4可以抑制细胞对葡萄糖的摄取，诱导高血糖状态及胰岛素抵抗。从本实验也可以看出，空腹血糖较高的 FK506处理大鼠，脂联素及瘦素表达明显降低，而抵抗素、内酯素及RBP4明显升高。同时，又有研究表明PTDM患者血清脂联素低于正常[11]，而高水平脂联素对PTDM起到了很好的保护作用。所以，FK506对脂肪因子的调变作用可以影响血糖的变化。

目前，普遍认为脂肪因子的分泌主要与脂肪组织上的PPAR-γ通路有关。激活的PPAR-γ，与维甲酸类受体或糖皮质激素受体形成异二聚体，结合于特异性的DNA序列而使得靶基因激活，从而发挥转录调控脂肪因子分泌的作用。多数文献报道，PPAR-γ激动剂促进脂联素[12]及瘦素分泌[13]，抑制抵抗素及内酯素分泌，改善胰岛素抵抗。本实验也发现：FK506处理大鼠PPAR-γ表达量明显降低，同时出现了脂联素、瘦素的表达降低和内酯素、抵抗素的表达明显升高，影响了正常的血糖调节机制,导致FBG明显升高。可以看出，PPAR-γ与脂肪因子的表达有着明显的一致性。FK506可以通过抑制PPAR-γ的表达，影响脂肪因子的分泌，诱导糖耐受损伤。

研究表明，leptin的表达与胰岛素的抵抗呈正向关系[14]，高浓度的leptin可能会抑制脂肪细胞PPAR-γ的表达[15-16]。这可能是与岛素的抵抗程度及研究的组织有关系，也说明PPAR-γ及leptin之间存在负反馈调节，具体机制有待进一步研究。

[参 考 文 献]

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