锰暴露工人XRCC1基因C26304T位点多态性与神经行为改变

姜 慧， 刘继刚，缪雪阳，申旭波，周希雷，邹 焰

(1.中国疾病预防控制中心 传染病预防控制处，北京 102206； 2.遵义市红花岗区人民医院， 贵州 遵义 563000； 3.遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563099； 4.遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义 563099)

锰是人类在工业和日常生活中广泛接触的一种金属，目前被认为是可能必需的人体微量元素，但摄入过量锰会造成全身多器官的危害，对大脑神经系统损伤最为严重，会造成神经系统永久性损失，甚至还会致癌、致畸、致突变[1-2]。据报道，过量锰会导致DNA链的断裂，链间的交叉连接出现错误、DNA的合成抑制和非程序性DNA修复合成等DNA损伤的现象[3-5]，引起细胞及机体的异常改变。X射线修复交叉互补基因1(X-ray repair cross complementing group, XRCC1)是一种重要的DNA碱基切除修复基因，在DNA损伤修复反应中发挥重要作用[6-7]。据郑玉新等[8]报道，在同样的作业环境、同样接触水平的工人中，并不是所有的接触者都发生相关损害，而仅有部分人发生，提示个体对锰损伤的敏感性和耐受性是有差异的。XRCC1作为DNA损伤修复基因，其多态性与锰接触者的神经行为改变是否有关，目前尚未有报道。该研究主要探讨XRCC1基因的各种多态与暴露于锰的工人神经行为改变的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 研究人群包括200名工龄在半年以上的贵州省锰铁合金厂冶炼工人，以及94名具相似劳动强度但环境中无锰暴露的贵州省硅铁合金厂工人。根据各工种作业场所空气锰浓度和工人接触锰作业的工龄，计算各研究者的累积暴露指数(Cumulative exposure index, CEI)，CEI=C×T , C是指工作场所平均空气锰浓度(mg/m3) , T是在C锰浓度下的作业工龄年。根据CEI将全部研究人群分为三组：高锰暴露组(CEI>0.4)；低锰暴露组(0.03

1.2 主要试剂和仪器 DNA提取试剂、PCR扩增试剂(天根生化科技北京有限公司)；限制性内切酶MspI(MBI公司，美国)；PCR扩增仪、凝胶成像系统(BIO-RAD公司，美国)；便携式个体空气采样器(SKC Inc，729861，美国)；空气采样流量校正仪(SENSIDYNE Inc，0501066-s，美国)；1.000 g/L锰溶液标准品(上海计量测试技术研究院)；火焰原子吸收仪(Varian，AA240FS，美国)；沟槽稳定试验测量仪(32010，美国普度大学)[9]；插板试验测量仪(32020，美国普度大学)[10]。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 研究人群佩戴空气个体采样器采集8 h工作场所的空气样本，采样器的滤膜孔径是PM2.50。同时采集其外周静脉血5 mL，肝素抗凝。

1.3.2 样品锰测定 先将空气样品用高氯酸和硝酸混合液(1∶9)消化至无色透明，置于电热板上蒸干，再用1%硝酸定容至10 mL，上石墨炉火焰原子吸收仪测定空气中锰浓度。

1.3.3 XRCC1基因多态性分析 DNA提取采用常规酚—氯仿法，基因多态性分析采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。人XRCC1基因DNA序列及C26304T位点信息从NCBI基因库获取，引物采用Primer premier 5.0软件设计，上游引物序列为5’-GCCCCGTCCCAGGTA-3’，下游引物序列为5'-AGCCCCAAGACCCTTTCACT-3’(上海捷瑞生物工程公司合成)。PCR反应体系是25 μL，ddH2O加入15.7 μL，PCR MasterMix加入 5.8μL，上下游引物各加入1 μL，DNA模板加入1.5 μL。PCR反应条件为：预变性95 ℃5 min；变性95 ℃1 min，退火58 ℃50 s，延伸72 ℃50 s，共35个循环；最后延伸72 ℃10 min。酶切体系是20 μL，ddH2O加入11 μL，10×buffer加入2 μL，内切酶MspI加入10U，PCR产物加入6 μL，混匀后温浴37 ℃3.5 h,然后水浴65 ℃15 min,使酶失活，酶切产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照并判读基因型。

1.4 神经行为检测

1.4.1 沟槽稳定试验 将沟槽稳定试验测量仪放于被检测者中央，然后进行划痕长度和碰撞次数测定，被检测者测试时不用任何方法支撑手或前臂，将测试笔由沟槽的最宽处向最窄处移动，检测2次，读取被检测者第1次碰触壁缘时的划痕长度,将2次划痕长度取其平均值；另计数从最宽处划到27 cm处时碰撞边缘次数， 取2次平均值。反映被试者眼手协调性和手稳定性。

1.4.2 插板试验 插板试验反映手臂、手和手指整体运动协调性以及手指尖的灵巧性，是一个组合操作，器械包括1根针、2个垫圈、1个环。将试验测试板放于被检测者前面，组合顺序是利手将针插入孔中，非利手再套1个垫圈在针上，利手又将1个环放在垫圈上，非利手再将另1个垫圈放在环上。针和空心环放在利手的一侧，圈垫放在非利手的一侧，练习2次后进行正式测试，测试时间60 s，记录完成组合数量。每完成1个组合计为4分，未完成的组合按完成的部分加分，完成一个部分增加1分，计算总分。

2 结果

2.1 锰累积暴露指数 锰高暴露组研究人群的CEI为1.710±0.8438，锰低暴露组研究人群CEI为0.165±0.0974，对照组研究人群CEI为0.014±0.0088。

2.2 XRCC1 C26304T位点电泳结果 C26304T位点经PCR扩增后的产物长度为491bp(见图1),由C→T突变使第194位密码子由精氨酸(Arg)变为色氨酸(Trp)，从而形成Arg194Trp多态性，MspI酶切后可出现313bp、292bp、178bp和21bp四个片段，其中野生纯合型(Arg/Arg)为292bp、178bp和21bp三个片段；突变纯合型(Trp/Trp)为313bp和178bp两个片段；杂合型(Arg/Trp)为313bp、292bp、178bp和21bp四个片段(见图2)。

注：M: 100bp DNA Ladder; 2,3,6,11: Arg/Arg基因型；1,4,7,10：Arg/Trp基因型; 5,8,9,12: Trp/Trp基因型。图2 XRCC1 C26304T 位点各基因型酶切产物琼脂糖凝胶电泳图象

2.3 神经行为检测改变和基因多态性的关系

2.3.1 工人基本情况 三组研究人群的年龄、文化水平、性别之间无差异(P>0.05)，见表1。

2.3.2 神经行为检测结果 高、低暴露组中的 XRCC1 C26304T 位点各基因型在垂直沟槽稳定试验的划痕长度检测、碰撞次数检测和插板试验得分三指标都有差异(P<0.05)，高暴露组的划痕长度和插板试验得分低于低暴露组，而碰撞次数多于低暴露组；并且携带突变基因型的研究人群其划痕长度、插板试验得分均低于携带野生基因型和杂合基因型的研究人群，碰撞次数高于野生基因型和杂合基因型(P<0.05)，对照组内各基因型无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表1三组研究人群基本情况

组别基因分型例数(%)年龄(x±s，岁)文化水平(x±s，年)性别(男/女)高暴露组CC34(33．7)34．847±6．0297．870±1．90428/6CT59(58．4)33．833±6．3537．426±3．55350/9TT8(7．9)31．000±8．6928．200±2．5307/1低暴露组CC22(22．2)33．415±7．17210．396±3．46013/9CT62(62．6)36．309±6．94610．181±3．01947/15TT15(15．2)34．167±7．1059．167±4．99711/4对照组CC34(36．2)36．961±5．8277．923±2．01824/10CT53(56．4)36．447±7．6388．277±1．76644/9TT7(7．4)38．900±8．0458．150±2．8156/1

注：CC为纯合型，CT为杂合型，TT为突变型。

表2 XRCC1 C26304T位点各基因型与神经行为改变的比较

名称基因分型划痕长度(cm)碰撞次数(次)插板试验(分数)高暴露组CC25．038±0．387∗△1．916±0．307∗△32．930±0．742∗△ CT21．920±0．352∗3．981±0．280∗28．550±0．675∗ TT19．235±0．8235．532±0．65425．049±1．577 低暴露组CC26．203±0．239∗△1．658±0．268∗△34．216±0．768∗△ CT23．096±0．231∗3．143±0．249∗30．788±0．713∗ TT20．914±0．7234．995±0．81025．730±2．319 对照组CC26．537±0．4631．969±0．43234．262±1．044 CT25．483±0．3382．543±0．31533．355±0．762 TT25．291±0．4742．947±0．44331．637±1．070

注：*代表CC、CT与TT之间的差异比较，P<0.05;△代表CC子与CT之间的差异比较，P<0.05。

3 讨论

XRCC1基因是一种重要的DNA碱基切除修复基因，定位于人类19号染色体长臂区(19q13.2-19q13.3)，其基因组大小约33kb，包含17个外显子，编码633个氨基酸，相对分子量69.5kD。其编码的蛋白可直接与DNA修复机制中的相关酶相结合形成复合体，在DNA损伤修复反应中主要参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复(BER)和单链断裂修复[2-4 ,6-7]。

据樊卫平等[11]的报道，过量锰进入机体后能作用于DNA和RNA，直接引起它们的损伤。给小鼠腹腔注射低剂量(10mg/kg)氯化锰，DNA链断裂显著增加，随着剂量的增加，DNA损伤越严重，提示锰可作为诱变剂造成DNA损伤，其作用机制可能是高浓度的Mn2+[12]引起的。

鉴于锰中毒晚期表现为不可逆的进行性病变，筛选出早期锰损伤者和易感人群是锰毒性研究中所需要的。本实验结果显示，高、低暴露组中携带XRCC1 C26304T位点基因型的工人划痕长度、碰撞次数、插板试验之间是有差异的，并且这个位点突变基因型工人的划痕长度、插板试验得分均低于携带野生基因型和杂合基因型的工人，碰撞次数高于野生型和杂合型。而对照组内各基因型无差异，提示暴露在较高锰环境中，携带突变基因型的工人更易发生锰对神经行为的改变，这也可能为郑玉新等观察到的职业性锰接触者在同样的作业环境中，同等接触水平的工人仅有一部分人才发生锰损伤[8]的现象提供了一定的解释依据。这也为将来进一步追踪研究不同XRCC1位点基因型接触工人的锰损害提供了基础数据。

XRCC1基因不仅与锰所致神经损害有关，还与其它一些慢性病如慢性阻塞性肺炎、肺癌、喉癌等的发生有关[13-16]，这也提示我们以后的研究还可扩大范围，观察其与锰对相关疾病的影响。

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