慢病毒介导的GOLPH3基因沉默对人胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响*

苏 婷， 赖铭裕， 农云翠

(广西医科大学第一附属医院 1消化内科， 2老年消化内科，广西 南宁 530021)

高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)，又名GMx33或GPP34，是新近发现的一个癌蛋白，定位于反面高尔基体网管状结构(trans-Golgi network，TGN)，可诱导正常细胞发生转化，促使细胞增殖和分化过程失去平衡，最终导致细胞恶性转化以及肿瘤的发生。2009年，Scott等[1]的研究发现肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等多种实体肿瘤中均存在5p13区域拷贝频率的异常增加，对此区域进行系统性分析后发现GOLPH3基因的表达与5p13区域的拷贝状态关系密切，并通过体内、体外等实验首次证实了GOLPH3是一个新的致癌基因。目前国内外关于GOLPH3与人类肿瘤发生的研究，如横纹肌肉瘤[2]、舌癌[3]、食管癌[4]、神经胶质细胞瘤[5]等，均有报道；其中，Hu 等[6]首次对GOLPH3与胃癌组织的关系进行了研究，结果发现GOLPH3在胃癌组织中的表达高于正常组织，提示GOLPH3可能是胃癌预后不良的预测因子。然而，抑制GOLPH3是否会对胃癌细胞的生长产生影响尚未清楚。本研究利用慢病毒介导的GOLPH3沉默载体(LV-GOLPH3-RNAi)转染至人胃癌SGC-7901细胞，构建GOLPH3沉默的稳转细胞株，并观察沉默GOLPH3基因对SGC-7901细胞生物学行为的影响，为临床上胃癌的诊治及预后奠定实验基础。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901(中国科学院上海细胞库)；RPMI-1640培养基(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青)；LV-GOLPH3-RNAi、scrambled序列及转染试剂(上海吉凯基因)；Trizol(Invitrogen)；RNA逆转录试剂盒、GOLPH3、β-actin引物和PCR扩增试剂盒(大连宝生物)；GOLPH3兔抗人多克隆抗体(Abcam)；β-actin抗体(上海康成)；山羊抗兔IgG Ⅱ抗(北京金桥)；MTT试剂(Solarbio)；Transwell小室(Corning)。

2 方法

2.1细胞培养 将复苏的SGC-7901细胞置于事先准备好的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中进行常规的培养和传代。

2.2慢病毒LV-GOLPH3-RNAi转染，建立稳定感染LV-GOLPH3-RNAi的SGC-7901细胞 转染前24 h，选取生长状态良好的SGC-7901细胞按(3～5)×105cells/well接种于6孔板中，培养24 h后，细胞融合率达到70%～90%时，根据预实验结果，选取含有干扰GOLPH3效果最佳的靶点序列(5’-TTCTTGACAAATGGGTGAA-3’)以及阴性对照组的scramble序列的病毒液按照慢病毒转染手册转染至SGC-7901细胞中，制备成稳定感染LV-GOLPH3-RNAi的SGC-7901细胞及阴性对照细胞；并收集同期未转染的SGC-7901细胞设为空白对照组。转染后12 h观察细胞状态，若无明显的细胞毒性作用，可48 h后更换为常规培养基；若有明显的细胞毒作用则12 h后立即更换为常规培养基。转染后72 h在倒置相差荧光显微镜下观察带有绿色荧光的SGC-7901细胞，转染效率(同一个视野，荧光显微镜下荧光细胞个数/光学显微镜下细胞个数)大于80%，则可进行扩大培养，用于后续实验。

2.3Real-time PCR检测GOLPH3 mRNA的表达 收集各个实验组(LV-GOLPH3-RNAi组、scrambled组和空白对照组)对数生长期的细胞，用Trizol法进行总RNA的提取，按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。取逆转录产物2 μL，总体系20 μL，以SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR反应，β-actin为内参照。利用Primer 5设计引物序列如下：GOLPH3 上游引物5’-ATCTGGATTACGTGGCTGTATGTTA-3’，下游引物5’-CGTTTCTGGAGGCTGAGTTTC-3’，产物大小为187 bp；内参照β-actin上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’， 产物大小为186 bp。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

2.4Western blotting检测GOLPH3蛋白的表达 收集各实验组细胞，加入RIPA及PMSF提取总蛋白液，将总蛋白液与上样缓冲液按5∶1的比例混合，经变性后制成蛋白质样品。配制5%浓缩胶和10%分离胶，将蛋白质样品加入孔道，进行SDS-PAGE电泳，电泳产物以100 mA恒流电转至PVDF膜，用5%蛋白封闭液室温于摇床上摇动封闭1 h，用TBST漂洗后置于稀释的Ⅰ抗(GOLPH3：1∶1 000；β-actin: 1∶10 000)中4 ℃孵育过夜，再次TBST漂洗后加入稀释的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室温置于摇床上孵育1 h，洗膜后进行显影、定影。以β-actin为内参照，用图像处理软件ImageJ对蛋白的条带进行半定量分析。

2.5MTT法检测各组细胞增殖力 收集各实验组处于对数生长期的细胞，调整细胞悬液浓度至5×103cells/well (100 μL)接种于96孔板中，每块96孔板均设LV-GOLPH3-RNAi组、scrambled组和空白对照组，每组设5个复孔，于接种后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h在培养基中加入20 μL MTT溶液，使MTT终浓度为0.5 g/L，于培养箱中继续培养4 h后弃液，加入等体积DMSO，摇床振荡10 min使结晶物完全溶解后，在酶联免疫检测仪用492 nm波长测各孔吸光度值，并绘制细胞生长曲线。

2.6Transwell实验检测GOLPH3沉默对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响 在Transwell侵袭实验中，按1∶8比例将Matrigel稀释于无血清培养基中，取上述稀释液30～50 μL加入Transwell上室使其覆盖整个聚碳脂膜上表面，于37 ℃培养箱中静置30 min ，使Matrigel凝结成胶。下室加入600 μL含15%胎牛血清的培养基，上室则加入制备好的细胞悬液200 μL(3×108/L)。常规培养24 h后取出Transwell小室，用棉签小心擦去上室聚碳脂膜表面未穿过的细胞，甲醛固定小室20 min后用0.1%结晶紫染色15 min，PBS冲洗晾干。将小室的下表面置于光学显微镜下进行观察，随机选取5个视野(上、中、下、左、右)进行计数并统计分析。迁移实验无需加入Matrigel包被Transwell上室聚碳脂膜，其余步骤与侵袭实验相同。每个实验组均重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 慢病毒高效转染SGC-7901细胞建立稳定转染细胞系

将LV-GOLPH3-RNAi和scrambled组的慢病毒颗粒转染至人胃癌细胞株SGC-7901并培养72 h后，于倒置相差荧光显微镜下观察转染效果，可见表达绿色荧光蛋白的细胞比例达80%以上，提示慢病毒转染成功并稳定表达，可继续后续实验，见图1。

2 慢病毒转染LV-GOLPH3-RNAi降低SGC-7901细胞GOLPH3 mRNA的表达

将LV-GOLPH3-RNAi和scrambled组的慢病毒颗粒转染至SGC-7901细胞，以β-actin为内参照，LV-GOLPH3-RNAi组、scrambled组和空白对照组GOLPH3 mRNA的相对表达量分别为0.28±0.04、1.62±0.11和1.66±0.19；LV-GOLPH3-RNAi组GOLPH3 mRNA的表达均低于scrambled组和空白对照组(P<0.05)，其表达量分别为上述2个对照组的17.28%和16.87%，干扰效率为82.72%和83.13%；而scrambled组和空白对照组的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

Figure 2. Relative mRNA expression of GOLPH3.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

3 慢病毒转染LV-GOLPH3-RNAi降低SGC-7901细胞GOLPH3蛋白的表达

与scrambled组和空白对照组对比，LV-GOLPH3-RNAi组的GOLPH3蛋白条带减弱，GOLPH3蛋白表达降低，差异有统计学意义(0.99±0.01、0.98±0.03和0.36±0.09，P<0.05)，LV-GOLPH3-RNAi组的GOLPH3蛋白表达量降低了63.63%和63.26%，scrambled组和空白对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

4 慢病毒转染LV-GOLPH3-RNAi抑制SGC-7901细胞的增殖力

根据MTT结果绘制各实验组生长曲线见图4，可见LV-GOLPH3-RNAi组SGC-7901细胞的增殖较scrambled组和空白对照组缓慢，并且该作用随着时间的增加而更为明显，观察至第5天，LV-GOLPH3-RNAi组的A值显著低于scrambled组和空白对照组(P<0.05)，其它各组比较差异无统计学意义。

Figure 3. The protein expression of GOLPH3.Mean±SD.n=3.1: scrambled group; 2: blank control group; 3: LV-GOLPH3-RNAi group.*P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

Figure 4. The effect of GOLPH3 silencing on the cell proliferation.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs scrambled group; #P<0.05 vs blank control group.

5 慢病毒转染LV-GOLPH3-RNAi抑制SGC-7901细胞侵袭和迁移能力

侵袭实验中，可见LV-GOLPH3-RNAi组穿过上室Matrigel和聚碳脂膜微孔的细胞数(33.5±3.0)低于scrambled组(85.0±3.9)和空白对照组(83.1±4.4;P<0.05)；迁移实验中，LV-GOLPH3-RNAi组穿过上室聚碳脂膜微孔的细胞数(56.7±1.5)低于scrambled组(186.0±3.4)和空白对照组(183.3±4.2；P<0.05)。侵袭和迁移实验中，scrambled组和空白对照组的差异无统计学意义，见图5。

Figure 5. Invasion assay (A) and migration assay (B).Magnification:×200.

讨 论

GOLPH3是由5p13区域基因编码的一种高度保守的蛋白，相对分子量约30 kD，由Wu等[7]于2000年首次在小鼠高尔基体中检测到，并参与保持高尔基体正常形态、蛋白质的加工和运输。Scott等[1]通过对5p13区域的研究发现GOLPH3有可能是肿瘤发生发展的一个重要因素，是一个新的致癌基因，能通过激活mTOR信号通路促进细胞的转化和肿瘤的生长，并增加肿瘤细胞对雷帕霉素的敏感性[8-9]。近年来的研究发现GOLPH3在多种肿瘤组织中高表达，已有证据[6]表明人类胃癌中也有GOLPH3的高表达，并且其高表达与预后不良相关。但GOLPH3与胃癌的迁移、侵袭能力的研究鲜见报道，为此我们进行了这一体外实验，探讨下调GOLPH3表达水平对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。

我国是胃癌高发的地区之一，虽然近年来发病率有所下降[10]，但因胃癌早期诊出率较低，其病死率并未下降。胃癌是多步骤、多因素共同作用所致发展，其形成与致癌基因的激活、抑癌基因的失活等密切相关。特异性地阻断胃癌中致癌基因的表达有可能抑制胃癌的发生发展。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是利用外源性或内源性的短双链RNA抑制细胞内特定基因的表达的一种技术，具有高效性、特异性和低毒性，目前广泛应用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等的研究[11]。应用慢病毒载体介导RNAi所致的基因沉默具有持久性和稳定性，并且无病毒蛋白的表达[12]，该技术在促进基因组学研究的进一步发展有重要作用。

本实验将载有GOLPH3干扰序列的慢病毒LV-GOLPH3-RNAi转染至SGC7901细胞，并检测到GOLPH3 mRNA和GOLPH3蛋白在LV-GOLPH3-RNAi组细胞中的表达水平明显下降，而在空白对照组和scrambled组中的表达差异无统计学意义，说明该载体能有效沉默GOLPH3，稳定沉默GOLPH3的细胞株构建成功，也证实了慢病毒介导的基因沉默技术具有稳定、持久的优势，是基因治疗的有力工具。后续实验中，我们发现下调GOLPH3的表达水平使得SGC7901细胞的增殖力减慢，而Zeng等[13]学者则报道了GOLPH3的过表达促进乳腺癌细胞的增殖，并与其较低的生存率相关，这说明了GOLPH3的水平与肿瘤细胞的增殖有极大的关系，与肿瘤早期的形成相关。在细胞迁移和侵袭实验中，我们发现LV-GOLPH3-RNAi组SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力明显低于对照组，这与GOLPH3水平和神经胶质细胞瘤的研究结果一致：下调GOLPH3的表达水平可明显降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[5]，说明GOLPH3在恶性肿瘤晚期的侵袭和转移中扮演重要角色。Scott等[1]的研究提示GOLPH3的作用与mTOR信号通路相关，而PI3K/Akt/mTOR信号转导通路参与调控包括胃癌在内的多种肿瘤的发生、发展、侵袭和转移[14]，有研究[15]表明PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502可抑制胃癌细胞的增殖和凋亡；但GOLPH3如何靶定该信号转导通路相关的分子来介导胃癌的侵袭、转移，目前尚未清楚，仍需更进一步的研究。

综上所述，本实验利用慢病毒载体将LV-GOLPH3-RNAi转染胃癌SGC-7901细胞，产生特异性的GOLPH3沉默效应，抑制了胃癌SGC-7901细胞的增殖，迁移和侵袭能力，该结果说明GOLPH3有可能参与胃癌早期的形成以及晚期的的侵袭、转移等行为，提示GOLPH3可作为潜在的肿瘤标记物及独立的预后因子。

[参 考 文 献]

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