骨髓间充质干细胞对脓毒症急性肺损伤大鼠肺内NF-κB影响的研究

张继峰+雒晓甜+侯林义+姜琴+吕洁萍+张文凯

[摘要] 目的 建立大鼠脓毒症急性肺损伤模型，探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在脓毒症大鼠急性肺损伤中的肺保护作用及可能机制，为临床治疗脓毒症急性肺损伤提供新的理论和实验依据。 方法 全骨髓培养法制备BMSCs。36只成年Wistar大鼠（150±15） g随机分为3组，Sham组、CLP组和BMSCs组，每组12只，CLP组和BMSCs组采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立脓毒症急性肺损伤模型，盲肠根部丝线结扎，盲肠切口5 mm，肠内容物漏出，将其回纳入腹腔，关腹。Sham组大鼠仅翻动盲肠，不结扎穿孔。BMSCs组术后经尾静脉注射BMSCs细胞悬液1 ml（1×106/ml）。实验结束后，应用ELISA测定血浆IL-10、MIP-2水平，左肺采用Western blot测定肺内NF-κB的表达水平，右肺制作病理切片，HE染色，并在光镜下观察肺组织病理结构改变。 结果 CLP组的血清MIP-2水平明显高于Sham组和BMSCs组，BMSCs组的血清MIP-2水平明显高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）；3组的血清IL-10水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3组的NF-κB表达水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。肺组织病理结果示CLP组和BMSCs组肺内大量炎症细胞浸润、肺间质水肿、肺内出血，BMSCs组症状较CLP组明显减轻。 结论 脓毒症急性肺损伤时，血浆MIP-2表达明显升高，肺内出血、水肿、大量炎症细胞浸润。BMSCs通过调控肺内炎症细胞NF-κB入核，使其促炎细胞因子MIP-2表达减少，减少中性粒细胞浸润起肺保护作用，暂不能说明BMSCs对IL-10有影响。

[关键词] 肺损伤；骨髓间充质干细胞；脓毒症；NF-κB；MIP-2

[中图分类号] R631[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（a）-0004-05

Impact study of bone marrow mesenchymal stem cells on NF-κB in rat with acute lung injury

ZHANG Ji-feng1 LUO Xiao-tian1 HOU Lin-yi1 JIANG Qin1 LV Jie-ping2 ZHANG Wen-kai3▲

1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Anesthesiology,the First Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China;3.Department of Surgical ICU,the Second Hospital Affiliated to Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

[Abstract] Objective To establish a rat model of acute lung injury with sepsis,to investigate the protective effect and possible mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in acute lung injury with sepsis in order to provide new theoretical and experimental basis in rat of acute lung injury with sepsis in clinic. Methods BMSCs was cultured by whole bone marrow culture.36 adult Wistar rats(150±15) g were randomly divided into three groups(Sham group,CLP group and BMSCs group),12 rats in each group.The method(cecal ligation and puncture(CLP)sepsis established model of acute lung injury,cecal ligation thread roots,cecal incision 5 mm,intestinal contents leaking it back into the abdominal cavity,the abdomen was closed)was used in CLP group and BMSCs group.Just flip the cecum,without ligation and puncture was used in Sham group.BMSCs group was injected via the tail vein BMSCs cell suspension 1 ml(1×106/ml).After the end of the experiment,plasma IL-10,MIP-2 levels were measured by ELISA,NF-κB expression level in lung left was measured by Western blot,the right lung were made in pathological section,HE staining was used and change of lung tissue was observed in the light microscope structure. Results MIP-2 level of CLP group was significantly higher than that of Sham group and BMSCs group respectively,MIP-2 level of BMSCs group was significantly higher than that of Sham group,with statistical difference(P＜0.05).IL-10 of three groups was compared,with no statistical difference(P＞0.05).NF-κB of three groups was compared,with statistical difference(P＜0.05). Conclusion MIP-2 significantly increased when acute lung injury with sepsis,pulmonary hemorrhage,edema and inflammatory cell infiltration.BMSCs lung inflammatory cells can reduce proinflammatory cytokines MIP-2 expression by regulating NF-κB into the nucleus and reduce the infiltration of neutrophils,it plays a protective role in the lung.Temporarily can not explain BMSCs affect IL-10.

[Key words] Lung injury;Bone marrow mesenchymal stem cells;Sepsis;NF-κB;MIP-2

脓毒症急性肺损伤是ICU常见危重症，如病情恶化很快发展为急性呼吸窘迫综合征，病死率极高，一直是临床治疗的难点[1-2]。肺损伤时大量炎症细胞在肺内浸润、聚集，多种炎症介质、细胞因子在肺内表达增强，抗炎、促炎平衡失调是导致肺损伤的关键因素[3-4]。最近研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可通过再生修复、免疫调节、抗氧化、抗凋亡等减轻急性肺损伤炎症反应，是一种极具吸引性的新的治疗方案[5]。本文采用盲肠结扎穿孔术复制大鼠急性肺损伤模型，通过股静脉注射BMSCs，注射后6 h评价肺损伤病理改变、细胞促炎和抗炎因子变化及肺组织NF-κB活性，探讨BMSCs在脓毒症大鼠急性肺损伤中的肺保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组雄性Wistar大鼠6只（3～4周），制备BMSCs。雄性Wistar大鼠36只（150～175 g）随机分为3组，假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）和骨髓间充质干细胞治疗组（BMSCs组），每组12只。实验大鼠由山西医科大学生理实验室动物中心提供。

1.1.2 主要试剂大鼠MIP-2、IL-10 ELISA试剂盒：北京四柏生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、低糖DMEM、双抗、胞核胞浆蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、荧光曝光Superstar ECL Plus、辣根过氧化酶羊抗兔二抗：杭州四季青生物工程材料有限公司；TBP pAb兔源多抗核内参（43 kD）、NF-κB P65兔源多抗一抗：Bioworld公司。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs提取及鉴定雄性3周左右Wistar大鼠1只，引颈处死，75%乙醇浸泡5 min，剪开皮肤分离大鼠股骨、胫骨，剪开两端，5号针头抽取含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液从股骨、胫骨两端反复冲洗骨髓腔，获得细胞悬液4 ml，接种于6 cm细胞培养皿中，37℃、5% CO2培养箱中进行原代培养，48 h后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次，细胞90%融合后用含EDTA的胰蛋白酶消化传代，至第三代呈不规则梭形（图1）用于实验。BMSCs流式细胞仪分析CD34阴性（0.92%）、CD44阳性（98.09%）（图2）。

1.2.2 模型制备参照文献[6-8]，将36只大鼠术前12 h禁食，不禁水，腹腔注射10%水合氯醛0.3 g/kg麻醉，正中开腹显露盲肠，CLP组和BMSCs组盲肠远端丝线结扎，近端切口5 mm，使肠内容物漏出，回纳入腹腔，关腹缝合，Sham组大鼠仅翻动盲肠，不结扎穿孔。BMSCs组术后即刻经股静脉注射BMSCs细胞悬液1 ml（1×106/ml）。

1.2.3 标本制备术后6 h腹主动脉采血3 ml，置于EP管中，静置2 h，以3000 r/min离心15 min，取其上清－20℃保存，用于MIP-2、IL-10的ELISA试剂盒检测。处死大鼠，剥离肺脏，右下肺放入4%的多聚甲醛溶液中固定，制作病理切片用于观察肺组织病理变化。左肺按照胞核与胞浆蛋白提取试剂盒（博士德公司）说明书规范操作，提取肺组织胞核蛋白，用于Western blot检测。

1.3 形态学观察及相关指标检测

1.3.1 形态学观察4%多聚甲醛溶液固定肺脏，HE染色光镜下观察肺组织变化。

1.3.2 血浆MIP-2、IL-10含量测定酶联免疫吸附试剂盒（ELISA北京四柏生物科技有限公司），按说明书规范操作。

1.3.3 肺组织NF-κB（P65）入核 Western blot法测定参照文献[9]，应用核蛋白抽提试剂盒提取肺组织核蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，进口PVDF膜（0.45 μm），2 mA/cm2半干转30 min，加NF-κB p65（Bioworld公司产品）兔抗鼠多克隆抗体（1∶800稀释）4℃摇床过夜，加辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（1∶2000稀释）室温摇床孵育1 h，Super ECL Plus超敏发光液发光，用TBP pAb作为核内参。曝光后图片采用Photoshop图像分析软件进行灰度分析。计算NF-κB与TBP pAb表达的相对灰度比值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以x±s表示，采用F检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清MIP-2、IL-10水平的比较

CLP组的血清MIP-2水平明显高于Sham组和BMSCs组，BMSCs组的血清MIP-2水平明显高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）；3组的血清IL-10水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 3组血清MIP-2、IL-10水平的比较（pg/ml，x±s）

与CLP组比较，*P＜0.05；与Sham组比较，#P＜0.05

2.2 3组NF-κB（P65）入核检测结果的比较

Sham组的NF-κB表达为（0.26±0.02），CLP组的NF-κB表达为（0.72±0.03），BMSCs组的NF-κB表达为（0.43±0.05），3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。3组的肺组织NF-κB（P65）入核Western blot检测结果见图3。

图3 3组大鼠肺组织NF-κB（P65）入核Western blot检测结果

2.3 3组大鼠肺组织的病理检查结果

Sham组可见大鼠肺泡大小均匀，结构完整，肺泡上皮细胞形态正常，肺泡间隔未见增宽，微血管无充血和淤血，肺间质间隙未见出血、水肿及炎症细胞浸润（图4A）；CLP组可见肺泡融合，肺间隔弥漫增厚，肺间质明显充血、水肿，大量中性粒细胞、巨噬细胞及红细胞浸润（图4B、图4C）；BMSCs组可见肺组织改变比CLP组有所减轻，仍有中性粒细胞浸润，肺呈轻度水肿改变，肺组织结构基本完整（图4D、图4E），表明BMSCs治疗后大鼠脓毒症肺损伤有一定程度的减轻。

3 讨论

脓毒症时炎症细胞（如肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等）在肺内浸润、聚集，过表达多种炎症介质和细胞因子，导致抗炎和促炎平衡失调，引起全身炎症反应是急性肺损伤发病机制的一个关键步骤[10]。脓毒症时受累肺脏发生炎症或出现急性呼吸窘迫综合征后，都会出现肺水肿、蛋白漏出、出血、炎症细胞浸润、微小血管损伤和血管壁通透性增加。血管内皮细胞激活和中性粒细胞浸润聚集是导致病变发展的病理生理基础，激活的中性粒细胞到达肺脏后，进一步分泌氧化产物、蛋白水解酶、一氧化氮及炎症介质导致肺部损伤[11]。脓毒症时前炎症细胞因子的表达，如TNF-α、IL-1不仅启动了炎症反应，而且参与维持炎症反应及一些趋化因子的产生，这些因子会活化中性粒细胞及血管内皮细胞，趋化中性粒细胞迁移到肺组织中。研究已证实小鼠动物模型盲肠结扎穿孔（CLP）模型中，受累的肺脏MIP-2表达及MPO增高[12-14]。最近研究表明，肺损伤模型中肺泡巨噬细胞分泌并表达C-X-C趋化因子，如MIP-2、核内NF-κB活性明显增高，且与肺功能受损程度密切相关[15-16]。