顺铂联合吡柔比星对脑胶质瘤U87细胞株增殖的抑制作用

虞欢东++++++于海涛++++++夏建国++++++李军++++++丁鸿飞++++++周红建++++++裴静波

[摘要] 目的 观察顺铂（CDDP）联合吡柔比星（THP）对脑胶质瘤U87细胞株增殖的抑制作用。 方法 采用MTT法检测不同浓度CDDP、THP以及两者联合应用时对U87细胞增殖作用的影响。 结果 随药物浓度增加，CDDP组、THP组和联合组对U87细胞增殖抑制作用逐渐增强（均P<0.01）。联合组对U87细胞增殖抑制率较同浓度CDDP组、THP组明显增加（P<0.05或P<0.01）。当CDDP和THP浓度为≤0.625μg/mL时，联合组Q值分别为1.72、1.31，两药联合应用具有协同作用，当CDDP和THP浓度≥1.25μg/mL时，联合组Q值分别为0.94、0.88、0.86、0.89，两药联合应用具有相加作用。 结论 CDDP联合THP较单纯的CDDP或THP抑制U87细胞增殖作用更强，具有浓度依赖性。在较低剂量下就能达到明显肿瘤抑制效应，对杀伤U87细胞具有确切协同效应。

[关键词] 脑胶质瘤；MTT；顺铂；吡柔比星；增殖

[中图分类号] R739.4[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2014）15-0001-03

Inhibition effect of cis-diaminedichloroplatinum(CDDP) combined with pirarubicin (THP) on cell proliferation of brain glioma U87

YU Huandong YU Haitao XIA Jianguo LI Jun DING Hongfei ZHOU Hongjian PEI Jingbo

Encephalopathy Center, Xiaoshan Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou, Hangzhou 311200, China

[Abstract] Objective To discuss inhibition effect of cis-Diaminedichloroplatinum (CDDP) combined with Pirarubicin (THP) on cell proliferation of brain glioma U87. Methods The MTT method was applied to detect the cell proliferation of brain glioma U87 in the influence by CDDP, THP and the combination of both under different concentration. ResultsAs the concentration of drugs rose, the influences on inhibition of cell proliferation of brain glioma U87 in CDDP group, THP group and combination group were enhanced gradually(P<0.01 on average). Compared with CDDP group and THP group under the same concentration, the inhibitory rate of cell proliferation obviously rose (P<0.05 or P<0.01). When the concentration in CDDP group and THP group was no more than 0.625μg/mL, the Q value in combination group were 1.72 and 1.31 respectively, which showed the coordination effect of combination of these two drugs. When the concentration in CDDP group and THP group was no less than 1.25μg/mL, the Q value in combination group were 0.94, 0.88, 0.86 and 0.89 respectively, which showed the additive effect of combination of these two drugs. ConclusionCompared with separate CDDP or THP, the combination of both CDDP and THP has more favorable inhibition of cell proliferation of brain glioma U87, with concentration dependent, which can achieve obviously tumor suppression effect under low dose, and has definitive coordination effect to kill and wound U87 cells.

[Key words] Brain glioma; MTT; Cis-Diaminedichloroplatinum(CDDP); Pirarubicins(THP); Proliferation脑胶质瘤是神经外科最常见的恶性疾病，约占颅内肿瘤的40％～50％[1]。脑胶质瘤的治疗方式以手术切除为主，术后常予以辅助性化疗，其中以顺铂为主的联合化疗是其目前常用的一线治疗方案[2,3]。由于肿瘤对化疗药的敏感性有很大差异，因此，脑胶质瘤的最佳化疗方案应是针对不同肿瘤特征为依据，选择较敏感化疗药进行个体化综合治疗。本研究观察了顺铂（CDDP）联合吡柔比星（THP）对脑胶质瘤细胞株U87细胞的增殖抑制作用，探讨两药在合适浓度下的协同抑制作用。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

脑胶质瘤细胞株U87由华中科技大学同济医学院脑外科实验室提供。胎牛血清、RPMI1640购于美国Sigma公司。CDDP、THP分别购于齐鲁制药公司（国药准字H37021358）和深圳万乐药业公司（国药准字H10930105）。MTT细胞增殖分析试剂为Promega公司产品，全波长酶标仪为Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及试剂配置脑胶质瘤细胞株U87细胞使用RPMI1640培养液（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2条件下培养箱中进行培养，定期更换培养液，待U87细胞增殖融合达80%左右进行消化传代。CDDP用PBS液配制成1mg/mL的储存液，THP用PBS液配制成1mg/mL储存液，储存于-70℃冰箱保存待用。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率[2] 取对数生长期的U87细胞，将U87细胞的浓度调至1.5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板中，CDDP组、THP组、联合组分别加入不同浓度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125）μg/mL的药物（每个浓度各设3个复孔），其中联合组根据两药同浓度进行相互组合。另外设置细胞空白对照组、药物单用组和联合药物组，各药物组设6个浓度水平，采用常规MTT法测定U87细胞的增殖抑制率。

1.2.3 协同作用Q值的测定[4,5]根据金正均的概率和法计算其Q值，Q=E（A+B）/[EA + （1-EA）×EB]，其中E（A+B）、EA和EB分别为两药联合作用时和两药单独作用时的U87细胞增殖抑制率。当计算的Q值为0.85～1.15时，表明两药联合具有相加作用；当计算的Q值>1.15时，两药联合具有协同作用；当计算的Q值<0.85时，表示两药联合具有拮抗作用。

1.3 统计学方法

应用SPSS18.0 for windows软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组内和组间差异比较均采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测三组药物培养48h时对U87细胞的增殖抑制率

培养48h时，随着药物浓度的增加，CDDP组、THP组和联合组对U87细胞的增殖抑制作用逐渐增强， 差异有统计学意义（均P<0.01）。联合组对U87细胞增殖抑制率较同浓度CDDP组、THP组明显增加， 差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表1。

2.2 CDDP和THP联合用药的协同作用结果分析

当CDDP和THP浓度为0.3125μg/mL、0.625μg/mL时，联合组的Q值分别为1.72、1.31，表示两药联合应用具有协同作用（Q>1.15）；当CDDP和THP浓度1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL时，联合组的Q值分别为0.94、0.88、0.86、0.89，表示两药联合应用具有相加作用（Q值为0.85～1.15）。

3 讨论

神经胶质瘤是脑外科较常见的原发性的脑部肿瘤，具有高发病率、高复发率和低治愈率的特点，预后相对较差，死亡率较高[6,7]。神经胶质瘤主要来源于神经间质细胞，包括星形细胞瘤（Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ 级）、少突神经胶质细胞瘤和混合型神经胶质瘤[8,9]。神经胶质瘤的治疗方式以手术切除治疗为主，但因神经胶质瘤其分化差、增殖快，常呈浸润性生长，与正常的脑组织间边界不是很清楚，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织,往往难以作到全部手术切除，一般均主张综合治疗[10-12]。目前临床上一般主张进行手术切除、术后放疗和化疗等综合治疗，尤其术后辅助化疗是预防其复发的关键，以延缓其复发和延长患者的生存时间，而联合用药可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[13-15]。

CDDP是常用神经肿瘤化疗药物之一，具有较强的抗癌活性，其机制主要是CDDP作为铂的金属络合物，进入癌细胞后逐渐水化成反式并水解，主要作用于DNA的链间和链内的交链结构，干扰癌细胞DNA的复制，导致肿瘤细胞死亡[16,17]。THP为细胞周期非特异性药物，其机制主要是THP分子很快进入核内，抑制DNA聚合酶，阻止核酸合成；药物嵌入DNA双螺旋链，使肿瘤细胞中止于G2期，导致细胞死亡。在单用CDDP或THP进行神经胶质瘤术后辅助化疗时，临床疗效不甚满意，这可能与肿瘤细胞的耐药性有关。肿瘤耐药机制与NF-κB的一些目标基因包括炎性因子基因、抗凋亡基因和多药耐药基因等众多影响细胞生长与凋亡的基因激活有关[18,19]。孙淑清等[20]证实脑胶质瘤中P170、MGMT、TOPII等蛋白表达与化疗药物敏感性密切相关，可指导临床选择合理化疗药物。本研究结果发现，随药物浓度增加，CDDP组、THP组和联合组对U87细胞增殖抑制作用逐渐增强，且联合组对U87细胞增殖抑制率较同浓度CDDP组、THP组明显增加，提示CDDP联合THP较单纯的CDDP或THP抑制U87细胞的增殖作用更强，具有浓度依赖性。同时研究发现当CDDP和THP浓度为≤0.625μg/mL时，Q>1.15，提示CDDP联合THP两药联合具有协同作用；当CDDP和THP浓度≥1.25μg/mL时，Q值为0.85～1.15，提示CDDP联合THP具有相加作用。

总之，CDDP联合THP较单纯的CDDP或THP抑制U87细胞的增殖作用更强，具有浓度依赖性。在较低剂量下就能达到明显肿瘤抑制效应，对杀伤U87细胞具有确切协同效应。

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（收稿日期：2013-12-17）