EB病毒在原发性扁桃体弥漫大B细胞淋巴瘤（PTDLBCL）中的表达及其临床意义

翟长文 王纾宜

（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科 上海 200032）

EB病毒在原发性扁桃体弥漫大B细胞淋巴瘤（PTDLBCL）中的表达及其临床意义

翟长文 王纾宜△

（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科 上海 200032）

目的探讨EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在原发性扁桃体弥漫大B细胞淋巴瘤（primary tonsillar diffuse large B cell lymphoma，PTDLBCL）内的感染情况及其临床病理学意义。方法采用EBV编码微小RNA（EBV encoded miRNA，EBERs）原位杂交（in situhybridization，ISH）和 EBV 潜伏膜蛋白1 （latent membrane protein 1，LMP1），PCR检测EBV在PTDLBCL（n=81）和原发性非扁桃体弥漫大B细胞淋巴瘤（primary nontonsillar diffuse large B cell lymphoma，PNTDLBCL）（n=42）、鼻腔 NK/T细胞淋巴瘤（n=10）及慢性扁桃体炎（n=20）中的感染情况，并分析差异。结果ISH结果显示，PTDLBCL中EBV的阳性率高于PNTDLBCL（t=5.603，P=0.018）。检测PTDLBCL中EBV，PCR阳性率显著高于ISH （t=11.139，P=0.001）。EBV阳性PTDLBCL者预后优于阴性者 （t=5.683，P=0.017）；与患者年龄、部位及性别的差异无统计学意义。结论EBV在PTDLBCL中高表达，其存在与患者预后正相关。检测PTDLBCL的EBV，LMP1 PCR的敏感度高于EBERs ISH，而EBERs ISH的特异度高于LMP1 PCR。

EB病毒（EBV）； 扁桃体； 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）； 预后； PCR； 原位杂交（ISH）

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是一种侵袭性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin＇s lymphoma，NHL），常侵犯淋巴结和淋巴结外器官或组织，复发率高，预后差。口咽部是结外淋巴瘤的一个发病部位，腭扁桃体（以下简称扁桃体）是咽淋巴组织环恶性淋巴瘤最容易累及的部位之一[1]，在扁桃体内淋巴瘤的发生率仅次于鳞状细胞癌，居第2位[2]。

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种嗜B淋巴细胞γ-疱疹病毒。目前检测EBV感染可采用血清学、组织学及基因学方法。血清学方法是通过检测机体应对EBV感染产生的特异性抗体明确感染，人群中血清学检出率高达90%，表示曾经或正在感染EBV[3]。原位杂交（in situhybridization，ISH）检测 EBV 编码微小 RNA（EBV encoded miRNAs，EBERs）是一种敏感、特异的检测方法。由于EBERs的稳定性及其出现于病毒感染的所有潜伏期，可在福尔马林固定石蜡包埋（formalinfixed paraffin-embedded，FFPE）组织中明确病毒感染细胞以及细胞内定位[4-5]。PCR是一种快速、特异的病毒检测方法，通过扩增EBV潜伏膜蛋白（latent membrane protein1，LMP1）基因，结合凝胶电泳明确EBV感染。后两种方法相对于血清学检测更能反映病变组织与EBV的相关性。

以往在DLBCL中EBV的检出率较低，认为其发生与EBV感染无关或相关性较低。近年来，随着研究的深入及检测技术的进步，越来越多的研究结果证实EBV在DLBCL中有一定的检出率。扁桃体作为DLBCL的一个发病部位，EBV在其内的感染情况及其临床病理学意义尚未定论。本实验采用EBERs ISH和LMP1 PCR检测EBV在原发性扁桃体DLBCL（primary tosillar DLBCL，PTDLBCL）中的感染情况并探讨其临床病理学意义。

资料和方法

病例收集与患者资料收集2009年1月至2012年1月在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院进行活检或手术摘除的PTDLBCL的FFPE组织。筛选病变组织较多、能够进行继续切片及临床资料完整的81例行EBERs ISH，选择其中标本量充足的31例行LMP1 PCR检测。收集慢性扁桃体炎20例及鼻腔NK/T细胞淋巴瘤10例行EBERs ISH及LMP1 PCR。收集复旦大学附属华山医院2011年1月至2013年1月确诊的42例原发性非扁桃体DLBCL （primary non-tonsillar DLBCL，PNTDLBCL）的FFPE组织。入组患者既往均无免疫缺陷，未接受过免疫抑制治疗，无淋巴瘤、自身免疫性疾病病史（表1）。

表1 患者基本临床资料及生存情况Tah 1 Demographic characteristics and survival situation of patients （n）

实验方法

EBERs ISH FFPE组织切成3μm/张，按原位杂交试剂盒（泰普生物科技有限公司）的实验步骤稍作改进，进行实验。鼻腔NK/T细胞淋巴瘤为阳性对照；以PBS代替一抗，为阴性对照。EBERsISH检测以至少一个肿瘤细胞核内出现特异性染色为阳性。重复实验排除假阳性结果。

LMP1 PCR FFPE组织按照临床样品基因组DNA微量试剂盒（QIAGEN）操作步骤行DNA抽提。以人β-globin基因为内参，检测抽提DNA的完整性，上游引物序列为5＇-CAGACACCATGGTGCACCTGAC-3＇，下 游 引 物 序 列 为 5＇-CCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTG-3＇，扩增 条 带 长 度 216 bp。EBV LMP1上游引物序列为5＇-AGCGACTCTGCTGGAAATGAT-3＇，下 游 引 物 序 列 为 5＇-TGATTAGCTAAGGCATTCCCA-3＇，扩增条带长度286 bp。PCR反应体系20μL，Hot Start聚合酶（TaKaRa DR007A）采用热启动PCR法进行扩增。阳性对照为鼻腔NK/T细胞淋巴瘤，阴性对照为同体积的双蒸水代替模板。重复实验排除假阳性结果。

统计学处理所有实验数据经SPSS 19.0（USA）及Stata 10.0运算，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

81例PTDLBCL中，20例EBERs ISH阳性（24.7%），61例阴性（75.3%，图1）。20例阳性中左侧10例，其中6例男性；右侧10例，其中6例女性。42例PNTDLBCL有3例EBERs ISH阳性。以31例PTDLBCL的FFPE组织抽提液为模板进行PCR，均能扩增出β-globin，18例LMP1阳性（图2），左侧8例，其中男性5例；右侧10例，其中女性7例。10例鼻腔NK/T淋巴瘤组织EBERs ISH及LMP1 PCR均呈阳性，20例慢性扁桃体炎中，两种方法均未检测到EBV存在。

图1 PTDLBCL的组织学特点和EBERs ISH（×400）Fig 1 Histology and ISH of EBERs in PTDLBCL（×400）A：HE；B：Positive EBERs ISH；C：Negative EBERs ISH；D：Positive EBERs ISH；E：Negative EBERs ISH，tonsillar chronic inflammation；F：Negative EBERs ISH.

图2 PCR结果Fig 2 PCR resultA：LMP1 in PTDLBCL；B：β-globin in PTDLBCL.1，2，3，4：Positive PTDLBCL；5：Black control；6：Positive control；7，8：Tonsillar chronic inflammation.

统计分析结果LMP1 PCR的敏感度为83.3%，特异度为48%，EBERs ISH的敏感度为27.7%，特异度为92.3%。LMP1 PCR的敏感度高于EBERs ISH，EBERs ISH 的特异度高于LMP1 PCR（表2）。用SPSS 19.0分析数据，PTDLBCL与PNTDLBCL在EBV阳性率上的差异有统计学意义（t=5.603，P=0.018，表3）；两种检测方法在PTDLBCL中EBV总体阳性率上的差异有统计学意义（t=11.139，P=0.001），31例 PTDLBCL标本均行两种检测方法，阳性率的差异均有统计学意义（t=11.681，P=0.001）。EBV 表达与患者预后正相关 （t=5.683，P=0.017，表 4），EBV 在PTDLBCL中临床病理学意义如表5所示。EBV在各年龄组PTDLBCL患者的感染率是相似的，老年患者组并没有较高的EBV感染率。另外，男女感染EBV的机会在统计学上是均等的，发病部位的左右差异无统计学意义。

表2 四格表比较31例PTDLBCL患者中两种检测方法Tah 2 Comparison of the two detection methods in the 31 cases of PTDLBCL hy four space form （n）

表3 PTDLBCL与PNTDLBCL中EBERS检测率的比较Tah 3 Detection rate of EBERS ISH in PTDLBCL and PNTDLBCL （n）

表4 PTDLBCL的预后与EBV感染的相关性Tah 4 Correlation of EBV and patients＇prognisis in PTDLBCL （n）

表5 PTDLBCL的临床病理特征表5 Clinicopathologic features of PTDLBCL （n）

讨 论

咽淋巴组织环（Waldeyer＇s环）是一个特殊的解剖学部位。扁桃体是 Waldeyer＇s环内最大的器官，是淋巴结与黏膜相关淋巴组织相移行的部位[6]。EBV是一种嗜B淋巴细胞γ-疱疹病毒，参与多种B细胞肿瘤的发生，如霍奇金淋巴瘤（Hodgkin＇s lymphoma，HL）、伯 基 特 淋 巴 瘤 （Burkitt＇s lymphoma，BL）及移植后淋巴组织增殖症等[3，7]。以往EBV在DLBCL中检出率较低，近年来，随着研究的深入及检测技术的进步，已有EBV在DLBCL中的检出率为6%[8]、8%～10%[9]、15%[10]甚至高达35.48%[11]的报道。鉴于EBV在人群中的普遍感染率及扁桃体部位的特殊性，本文意在探讨PTDLBCL内EBV感染情况。

由于组织样本量的限制，我们只能在31例PTDLBCL中进行PCR扩增LMP1。LMP1的PCR检测结果（18/31）与EBERs的ISH检测结果（20/81）之间的差异有统计学意义（t=11.139，P=0.001）。在31例PTDLBCL中比较两种检测方法：LMP1 PCR的敏感度较高，EBERs ISH的特异度较高。两种检测方法在结果上的差异只能从检测目标物及方法学上寻求原因。LMP1是EBV潜伏感染产物，具有确切的致瘤作用。在体外，LMP1促进B细胞转化及永生化[12]，它可以通过多种途径导致肿瘤发生[8，13-14]。LMP1可以作为EBV感染转化细胞的标志物。LMP1的PCR检测费时费力，与EBERs的ISH检测相比，需较多的组织样本量，检测费用较高，若实验控制不佳可出现假阳性，临床实用性不及ISH。EBERs在EBV潜伏感染的细胞中表达丰富，聚集于细胞核内[15]。EBERs表达水平的上升会增加细胞的瘤变性[16]。ISH检测EBERs所需组织样本量少，但并非所有EBV感染的细胞中都能检测到EBERs。EBV相关的鼻咽癌组织中EBERs的表达有不均一性[17]，肿瘤细胞的分裂导致病毒基因丢失使此区域检测不到EBERs[15]。另外组织中与探针有限的结合位点和探针的渗透性也限制了ISH的敏感度[16]。

慢性扁桃体炎性组织中没有检测到LMP1扩增，81例PTDLBCL中EBV的检出率为24.7%。说明EBV在人群中有较高的普遍感染率，但病毒以不危害宿主的方式存在[18]。在部分患者中，EBV可能对感染的B细胞进行基因整合，实现转化进而达到瘤变的目的。EBV基因在受感染细胞内整合与否与其致病密切相关，这有利于揭示EBV阳性的B细胞淋巴瘤的发病机制。

81例PTDLBCL中EBERs ISH阳性率为24.7%，42例PNTDLBCL中EBERs ISH阳性率为7%。EBV在PTDLBCL中的检出率统计学上显著高于PNTDLBCL，同时也高于部分已知研究结果，我们考虑有以下3个方面的原因。

首先，关于DLBCL中EBV的检出率的报道涉及全身多个部位，包括胃肠、肺、睾丸、神经系统、扁桃体以及淋巴结各器官[8-10，19]。彭金昀等[20]验证了DLBCL中EBV的感染存在部位依赖性。扁桃体的特殊解剖位置可能是其内有较高EBV检出率的主要原因：其位于消化道和呼吸道的交汇处，黏膜内含有丰富的淋巴组织，是接触各类病原微生物等抗原的门户。生发中心B细胞随时发生着高频突变，比其他部位的B细胞更易于发生恶性转变[21]。细胞因子及其受体在EBV相关的扁桃体B细胞淋巴瘤的发生中起一定作用，其中CXCR4、CXCR5和CCR7因EBV感染而表达上调[22]。EBV感染后，扁桃体内EBV相关的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）因病毒IL-10（viral IL-10，vIL-10）的表达而活性降低[21]。因此，在扁桃体内较有利的微环境下EBV感染的B淋巴细胞较其他部位更易于存活、接受转化及达到瘤变。

其次，阳性判断标准的不同也可能是阳性率差异的一个原因。EBERs ISH目前还没有统一的判断标准，有学者提出至少在一个肿瘤细胞核中出现特异性染色即判定为阳性[23]，也有以阳性率≥10%[10]或＞20%[24]为标准。为规范化比较EBV检出率，亟需建立统一的判断标准。鉴于EBERs ISH较少出现假阳性，特异性较高，同时参照文献数据，本研究将阳性判断标准设定为切片中至少一个肿瘤细胞核内出现特异性染色为阳性。PNTDLBCL内EBV检出率（7%）与文献相似，说明扁桃体的特殊部位导致的EBV检测率差异所占比重较大，尚需加大样本量来证实此结论。

再次，地区及种族差异也可能是阳性率不同的原因，在亚洲和拉丁美洲DLBCL患者中EBV的感染率为9%～15%，在西方国家约为5%[25]。2008年文亦磊等[11]在研究124例淋巴结外DLBCL中发现，EBERs阳性率为35.48%，明显高于西方国家及本实验结果。

EBV在各年龄组PTDLBCL患者中的感染率相似，老年患者组未发现较高的EBV感染率。男女感染EBV的机会在统计学上是均等的，发病部位（左，右）的差异无统计学意义。

PTDLBCL患者中，EBV阳性者的预后优于阴性者，差异有统计学意义，可能由于病毒阳性者与阴性者之间的发病机制不同所致。阳性者由于病毒感染，B细胞发生基因改变，继而发生永生化；而阴性者B细胞可能在其他因素的作用下发生肿瘤变。另外，EBV的存在可能会持续激发机体局部免疫反应，趋化各类炎性细胞及因子的浸润，对抗病毒感染的同时应对肿瘤免疫。我们会继续关注这方面的现象，并致力于其具体原因的研究。

综上所述，对于检测PTDLBCL组织中EBV的存在，LMP1 PCR的敏感度较高，EBERs ISH的特异度较高。PTDLBCL在EBV感染率上显著高于PNTDLBCL。EBV的存在与扁桃体DLBCL患者预后正相关，与患者发病年龄、部位及性别的相关性无统计学意义。EBV在扁桃体DLBCL的发生中如何发挥作用及其具体机制有待进一步研究。

致谢复旦大学附属华山医院病理科提供了PTDLBCL对照标本。复旦大学上海医学院病理学系给予了技术上的支持和指导。

[1] 邢蔚，陈萍.扁桃体恶性淋巴瘤误诊2例[J].川北医学院学报，2010，25（3）：287-288.

[2] Wada N，Ham MF，Fujita S，et al.Malignant lymphomas in Waldeyer＇s ring in Asian countries：Association with histologic types and Epstein-Barr virus[J].Mol Med Rep，2008，1（5）：651-655.

[3] Vrazo AC，Chauchard M，Raab-Traub N，et al.Epsteinbarr virus LMP2A reduces hyperactivation induced by LMP1 to restore normal B cell phenotype in transgenic mice[J].PLoS Pathog，2012，8（4）：e1002662.

[4] Fanaian NK，Cohen C，Waldrop S，et al.Epstein-barr virus（EBV）-encoded RNA：automated in-situ hybridization（ISH） compared with manual ISH and immunohistochemistry for detection of EBV in pediatric lymphoproliferative disorders[J].Pediatr Dev Pathol，2009，12（3）：195-199.

[5] Mohammadianpanah M，Daneshbod Y，Ramzi M，et al.Primary tonsillar lymphomas according to the new World Health Organization classification：to report 87 cases and literature review and analysis[J].Ann Hematol，2010，89（10）：993-1001.

[6] Ree HJ，Ko YH，Kwon MS，et al.Detection of germinal center B-cell lymphoma in archival specimens：critical evaluation of Bcl-6 protein expression in diffuse large BCell lymphoma of the tonsil[J].Hum Pathol，2003，34（6）：610-616.

[7] de la Hera MA，Montes-Moreno S，Hernandez SG，et al.Early phase of Epstein-Barr virus（EBV）-positive diffuselarge B cell lymphoma of the elderly mimicking EBV-positive reactive follicular hyperplasia[J].Histopathology，2011，59（3）：571-575.

[8] Zhao P，Lu YL，Liu L，et al.Aberrant cytoplasmic expression of cyclin B1 protein and its correlation with EBV-LMP1，P53 and P16（INK4A）in classical hodgkin lymphoma in China[J].Pathol Oncol Res，2011，17（2）：369-373.

[9] Hofscheier A，Ponciano A，Bonzheim I，et al.Geographic variation in the prevalence of epstein-barr virus-positive diffuse large B-cell lymphoma of the elderly：a comparative analysis of a Mexican and a German population[J].Mod Pathol，2011，24（8）：1046-1054.

[10] Beltran BE，Morales D，Quinones P，et al.EBV-positive diffuse large B-cell lymphoma in young immunocompetent individuals[J].Clin Lymphoma Myeloma Leuk，2011，11（6）：512-516.

[11] 文亦磊.应用原位杂交和荧光原位杂交技术研究结外弥漫性大B细胞淋巴瘤与EB病毒感染及其基因异常的关系[D].广西：广西医科大学，2008.

[12] Guo L，Tang M，Yang L，et al.Epstein-Barr virus oncoprotein LMP1 mediates survivin upregulation by p53 contributing to G1/S cell cycle progression in nasopharyngeal carcinoma[J].Int J Mol Med，2012，29（4）：574-580.

[13] Saha A，Robertson ES.Epstein-Barr virus-associated B-cell lymphomas：pathogenesis and clinical outcomes[J].Clin Cancer Res，2011，17（10）：3056-3063.

[14] Zuercher E，Butticaz C，Wyniger J，et al.Genetic diversity of EBV-encoded LMP1 in the swiss HIV cohort study and implication for NF-Kb activation[J].PLoS One，2012，7（2）：e32168.

[15] Hanel P，Hummel M，Anagnostopoulos I，et al.Analysis of single EBER-positive and negative tumour cells in EBV-harbouring B-cell non-Hodgkin lymphomas[J].J Pathol，2001，195（3）：355-360.

[16] Sheikh TI，Qadri I.Expression of EBV encoded viral RNA 1，2 and anti-inflammatory cytokine （interleukin-10）in FFPE lymphoma specimens：a preliminary study for diagnostic implication in Pakistan[J].Diagn Pathol，2011，6：70.

[17] Hippocrate A，Oussaief L，Joab I.Possible role of EBV in breast cancer and other unusually EBV-associated cancers[J].Cancer Lett，2011，305（2）：144-149.

[18] Dogan B，Rota S，Gurbuzler L，et al.The correlation between EBV viral load in the palatine tonsils of patients with recurrent tonsillitis and concurrent serum titers of VCA-IgG[J].Eur Arch Otorhinolaryngol，2010，267（1）：143-148.

[19] Maeshima AM，Taniguchi H，Fukuhara S，et al.Bcl-2，Bcl-6，and the International Prognostic Index are prognostic indicators in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab-containing chemotherapy[J].Cancer Sci，2012，103（10）：1898-1904.

[20] 彭金昀，唐运莲，何洁，等.不同部位和类型恶性淋巴瘤与EBV感染相关性研究[J].中国肿瘤临床，2008，35（20）：1145-1149.

[21] Al-Salam S，Dhaheri SA，Awwad A，et al.Prevalence of Epstein-Barr virus in tonsils and adenoids of United Arab Emirates nationals[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2011，75（9）：1160-1166.

[22] Ehlin-Henriksson B，Liang W，Cagigi A，et al.Changes in chemokines and chemokine receptor expression on tonsillar B cells upon Epstein-Barr virus infection[J].Immunology，2009，127（4）：549-557.

[23] Chabay P，Lara J，Lorenzetti M，et al.Epstein Barr virus in relation to apoptosis markers and patients＇outcome in pediatric B-cell Non-Hodgkin lymphoma[J].Cancer Lett，2011，307（2）：221-226.

[24] Beltran BE，Castillo JJ，Morales D，et al.EBV-positive diffuse large B-cell lymphoma of the elderly：a case series from Peru[J].Am J Hematol，2011，86（8）：663-667.

[25] Castillo JJ，Beltran BE，Miranda RN，et al.Epstein-Barr virus-positive diffuse large B-cell lymphoma of the elderly：What we know so far[J].Oncologist，2011，16（1）：87-96.

Epstein-harr virus infection in primary tonsillar diffuse large B cell lymphoma（PTDLBCL）and its clinical significance

ZHAI Chang-wen，WANG Shu-yi△
（Department of Pathology，Eyes，Ears，Nose and Throat Hospital，Fudan University，Shanghai200032，China）

epstein-barr virus（EBV）； tonsillar； diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）；prognosis； PCR；in situhybridization（ISH）

R 766

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.012

2013-05-16；编辑：王蔚）

△Corresponding author E-mail：wangshuyi@eent.shmu.edu.cn

【Ahstract】 OhJectiveTo study the infection of Epstein-Barr virus（EBV）in primary tonsillar diffuse large B cell lymphoma（PTDLBCL）and its clinical significance.MethodsThe infection of EBV in the tissues of PTDLBCL（n=81），primary non-tonsillar diffuse large B cell lymphoma（PNTDLBCL）（n=42），nasal NK/T cell lymphoma（NK/T）（n=10）and tonsillar chronic inflammatory conditions（n=20）were detected with EBV encoded miRNA （EBERs）in situhybridization（ISH）（n=123）and latent membrane protein 1（LMP1）gene PCR（n=31）.The difference of EBV detection between them were analyzed.ResultsEBERs ISH result showed that the detection rate of EBV in PTDLBCL was statistically higher than that in PNTDLBCL （t=5.603，P=0.018）.The detection rate of EBV using LPM1 PCR was statistically higher than using EBERs ISH （t=11.139，P=0.001）in PTDLBCL.EBVwas statistically significant positive correlation with patient＇s prognosis（t=5.683，P=0.017）；EBV was not significantly related with age，primary location and gender of patients with PTDLBCL.ConclusionsThe higher detection rate of EBV in PTDLBCL is positively related with patients＇prognosis.In the detection of EBV in PTDLBCL，LMP1 PCR was more sensitivity than EBERs ISH，while EBERs ISH was more specificity than LMP1 PCR.