假龙胆总多酚含量测定及抗氧化活性研究

宋海龙 朱国强 卢晓丽 田树革 贾晓光

·论著·

假龙胆总多酚含量测定及抗氧化活性研究

宋海龙 朱国强 卢晓丽 田树革 贾晓光

目的建立假龙胆总多酚含量的测定方法。方法采用可见分光光度法测定假龙胆中总多酚的含量，并建立清除羟基自由基和超氧阴离子自由基两种抗氧化模型对假龙胆抗氧化能力进行评价。结果以没食子酸作为测定总多酚含量的对照品，在浓度0.05～0.3 mg (r=0.9999)范围内呈良好的线性关系，结果表明，总多酚含量平均值为7.63 mg，假龙胆提取液具有良好的抗氧化能力。结论此方法操作简便，重现性良好、稳定，可作为假龙胆总多酚的检测方法，并可作为天然抗氧化剂资源进行开发研究。

假龙胆；总多酚；抗氧化

假龙胆属Gentianella属于龙胆科，根据多方面的研究结果，假龙胆属为一单系属，全球约有125种，中国有9种，主要分布于东北、西北及西南部[1]。新疆假龙胆Gentianellaturkestanorum为1年或2年生草本植物，全草入药[2-4]。本文对新疆假龙胆的总多酚及抗氧化能力进行测定，为假龙胆检测提供新的方法依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Spectrumlab 22可见分光光度计(上海棱光技术有限公司制造)；KQ2200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AL204电子天平(梅特勒—托利多仪器有限公司)。

1.2 实验材料

药材：假龙胆(产地：新疆奇台县兴场大东沟；经纬度：E89°53′ N43°35′ 高度：1659.8 m)药材粉碎，过40目筛，即得。

试剂：维生素C(vitamin C，Vc)三羟基甲基氨基甲烷、冰醋酸、香草醛、碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、双氧水、无水乙醇、甲醇均为分析纯，实验用水为蒸馏水。没食子酸对照品(天津市光复精细化工研究所，含量：99%)。

2 实验方法

2.1 试剂的制备

福林酚试剂的制备：称取钨酸钠50 g，钼酸钠12.5 g，用350 ml蒸馏水溶解于圆底烧瓶中，加入25 ml磷酸(≥85%)和50 ml浓盐酸充分混匀，小火加热回流12小时，放冷，再加入75 g硫酸锂、25 ml蒸馏水及0.1ml双氧水，开口继续沸腾15分钟，使得双氧水完全挥发，冷却后用蒸馏水定容至500 ml，过滤，于棕色瓶中避光储存。试液应呈亮黄色，如放置后变为绿色，可加双氧水0.2 ml，煮沸15分钟即可[5-7]。

对照品溶液液的制备：精密称取5.0001 mg没食子酸化学对照品于100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，制成浓度为0.05 mg/ml总多酚对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

称取假龙胆药材1 g，加入65%的乙醇25 ml超声处理30分钟，离心，将上清液定容至100 ml，即得。

2.3 最佳测量波长的选择

准确吸取1.5 ml总多酚对照储备液于25 ml容量瓶中，分别加入18.0 ml蒸馏水、福林试剂1 ml，用15%Na2CO3溶液定容，于30℃水浴中恒温反应1.5小时。以蒸馏水为空白对照，在650～800 nm波长下扫描其吸光度，结果表明没食子酸在758 nm处有强吸收峰，故选择758 nm作为总多酚的测定波长。

2.4 清除羟基自由基能力

2.5 清除超氧阴离子能力

3 结果

3.1 标准曲线

取总多酚对照品溶液1 ml 、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml于10 ml容量瓶中蒸馏水定容，分别取上述溶液各3 ml加3 ml水，然后加0.5 ml福林酚试剂，最后加1.5 ml的20%碳酸钠溶液混匀，加水定容，75℃加热10分钟，758 nm波长下测定吸光度，以浓度为横坐标，测定得吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程Y=0.2034X+ 0.0502，r=0.9999，线性范围0.005～0.03 mg/ml。

3.2 方法学考察

3.2.1 稳定性试验 精密吸取同一份总多酚供试品溶液3 ml，加入蒸馏水3 ml，分别于0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟按照“3.1”方法显色后测定吸光度值，计算得到假龙胆总多酚含量的RSD为1.05%，样品在60分钟内显色稳定。

3.2.2 精密度试验 取6份总多酚对照品溶液，每份3 ml，按照“3.1”方法显色后测定吸光度值，计算得到薰衣草总多酚含量的RSD为1.58%，说明该方法测定假龙胆总多酚含量精密度良好。

3.2.3 重现性试验 取同一批假龙胆样品6份，分别按照“2.2”方法制成总多酚供试品溶液，每份精密吸取3 ml，按照“3.1”方法显色后测定吸光度值，计算得到RSD为2.88%，表明该方法测定假龙胆总多酚含量重现性良好。

3.2.4 加样回收率试验 精密吸取已知浓度的总多酚供试品溶液9份分成3组，每份1.5 ml，分别精密加入高、中、低不同浓度的总多酚对照品溶液适量，按照“3.1”方法显色后测定吸光度值，并计算回收率，结果见表1。

表1 假龙胆中总多酚的回收率

3.3 样品含量测定

取假龙胆三份，每份平行3个样品，按照“2.2”方法制成总多酚样品溶液，每份精密吸取3 ml，按照“3.1”方法显色后测定吸光度值，结果如表2。

表2 假龙胆中总多酚含量(n=3)

3.4 对羟基自由基的清除能力

由图1分析可知，假龙胆提取液和阳性对照Vc对羟基自由基的清除作用均随着浓度的增大而增加。当浓度为40 μg/ml时，假龙胆提取液对羟基自由基的清除作用是Vc对羟基自由基的清除作用的2.97倍；当浓度为400 μg/ml时，假龙胆提取液对羟基自由基的清除作用是Vc对羟基自由基的清除作用的1.13倍。假龙胆提取液对羟基自由基的清除作用整体大于Vc对羟基自由基的清除作用。

图1 对羟基自由基的清除能力

3.5 对超氧阴离子的清除能力

由图2分析可知，假龙胆提取液和阳性对照Vc对超氧阴离子的清除作用均随着浓度的增大而增加。当浓度为40 μg/ml时，Vc对超氧阴离子的清除作用比假龙胆提取液对超氧阴离子的清除作用小；当浓度为400 μg/ml时，Vc对超氧阴离子的清除作用是假龙胆提取液对超氧阴离子的清除作用的1.66倍。在40～400 μg/ml浓度范围内，假龙胆提取液对超氧阴离子的清除率增长趋势较为平缓，而Vc对超氧阴离子的清除作用增长趋势较大。

图2 对超氧阴离子的清除能力

4 结论

从研究结果可以看出，假龙胆中具有较为丰富的总多酚，采用可见分光光度法测定假龙胆总多酚含量，简单易行，重现性好，结果稳定可靠，可作为测定假龙胆药材总多酚含量的检测方法。对假龙胆抗氧化作用研究发现，假龙胆提取液具有一定的抗氧化能力，可作为天然抗氧化资源进行开发。

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(本文编辑： 董历华)

Gentianellaturkestanorum(Gand.)Holub.totalpolyphenolcontentandantioxidantactivitydetermination

SONGHai-long，ZHUGuo-qiang，LUXiao-li，etal.

XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China

JIAXiao-guang，E-mail：xgjia@vip.sina.com.cn

ObjectiveTo establish a method for the determination of total Polyphenol inGentianellaturkestanorum(Gand.) Holub.MethodsThe total Polypheno land in Gentianaceae was determined by visible spectrophotometry，and establish two kinds of anti-oxidation model-scavenging hydroxyl radicals and scavenging superoxide anion radicals-to evaluate Gentianella turkestanorum (Gand.) Holub. in its antioxidant ability.ResultsThe method had a good linearity in the range of 0.05～0.3 mg(r=0.9999)with gallic acid as the reference substance. The results showed that an average total polyphenol content of 7.63 mg，Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub. extracts had good oxidation resistance.ConclusionsThis method was simple，with good reproducibility，and stability， and could be adopted as the standard method for detectingGentianellaturkestanorum(Gand.) Holub. total polyphenols.Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub , as a natural anti-oxidant resources, is worth further research and development.

Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub.； Total Polyphenol； Antioxidant activity

新疆维吾尔药与特色天然药物创制及产业化示范项目(201130105-1)；重大公共卫生专项——全国第四次中药资源普查新疆(试点)项目(2100409)

830001 乌鲁木齐，新疆中药民族药研究所科教科[宋海龙(硕士研究生)、朱国强、贾晓光)]；新疆医科大学中医学院中药系[卢晓丽(硕士研究生)、田树革)]

宋海龙(1973- )，2102级在职硕士研究生，实验师。研究方向：食品加工与安全。E-mail：xjwssong@126.com

贾晓光(1955- )，硕士，主任药师，硕士生导师。研究方向：中药资源与化学。E-mail：xgjia@vip.sina.com.cn

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.007

2013-11-20)