血清microRNA表达谱对原发性胆汁性肝硬化的诊断价值

潘腾莉，孙莉，周兴蓓，陈丽，於学军，谭友文

（1.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2.镇江市第三人民医院肝病科，江苏镇江212005）

血清microRNA表达谱对原发性胆汁性肝硬化的诊断价值

潘腾莉1，2，孙莉2，周兴蓓2，陈丽2，於学军2，谭友文2

（1.江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2.镇江市第三人民医院肝病科，江苏镇江212005）

目的：寻找原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者血清中差异表达的microRNAs。方法：首先，将PBC组和健康对照组血清标本各3例各自混合，采用Illumina GAⅡx高通量测序技术分析上述2组样本，筛选出PBC患者与健康对照者表达差异有统计学意义的miRNAs；其次，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对差异表达的miRNAs在扩大标本中进行验证。最后，预测miRNAs的靶基因并进一步分析其作用。结果：高通量测序技术筛选出143条miRNAs表达差异有统计学意义，其中，22条差异倍数＞2倍。经过qRT-PCR验证，miR-122，miR-141，miR-34a在PBC组中的表达水平明显高于对照组，与测序结果表达趋势一致。靶基因预测结果显示，在细胞核和细胞质中，miRNAs主要通过与蛋白质结合发挥信号转导的作用。结论：PBC患者存在差异表达的miRNAs，且其对PBC的诊断有一定的参考价值。

原发性胆汁性肝硬化；miRNA；高通量测序

MicroRNA（miRNA）是长度18～22 bp的核苷酸序列，通过3′UTR区域与宿主mRNA结合，降解或抑制其表达。研究表明，miRNA在机体发育、肿瘤形成和转移、细胞凋亡和坏死等众多病理生理过程中发挥着重要的调控作用。其中，研究最多的是miRNA对肿瘤发生发展及预后的调控作用［1－4］。近年来，miRNA与免疫调节机制的作用受到越来越多的关注［5－7］。原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种原因不明的，以肝内中小胆管淋巴细胞浸润、小胆管炎性破坏、血清特征性抗线粒体抗体（antimitochondrial antibody，AMA）阳性为特征的进行性非化脓性破坏，主要临床表现为肝内胆汁淤积，是一种以女性发病为主的慢性自身免疫病［6，8］。研究表明，在环境或遗传因素的作用下，免疫细胞分化、发育与活化过程中固有的精细调节机制被破坏，导致免疫系统对自身组织产生免疫应答，这是PBC发生与发展的根本原因［9］。但是，具体的发病机制有待于进一步阐明。本研究旨在寻找PBC患者中存在差异表达的miRNA，评估其对PBC的诊断价值，并对其作用机制进行初步阐述。

1 对象和方法

1.1 病例

23例PBC患者和23例健康对照者血清标本均来自于2012年6月至2013年11月镇江市第三人民医院的门诊与住院患者。对照组为在本院体检的健康志愿者。其中，随机选取PBC组和对照组血清标本各3例分别进行混合测序，其余标本用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证。

PBC的诊断标准参照国际诊断指南［9］：肝脏的组织学诊断与PBC一致；胆汁淤积的肝功能试验；间接免疫荧光法测得抗线粒体抗体（AMA）阳性。

本研究所有标本的收集均通过镇江市第三人民医院伦理委员会的同意。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 患者在初次门诊或住院时采集全血5 mL于医用血清管中（无肝素抗凝），上下轻轻颠倒混匀，立即4℃保存，于2 h内4 000×g，离心10 min。取上层血清至1.5 mL离心管中（无RNA酶），13 000×g，离心2 min。最后将上清液转移至2 mL离心管中（无RNA酶），每管吸入250μL血清进行分装，弃血细胞沉淀。置于－80℃长期保存。

1.2.2 总RNA提取与文库构建 血清RNA的提取按照LCSTRK1001试剂盒说明书操作。小RNA文库构建采用Illumina Truseq Small RNA Preparation kit试剂盒（LC Sciences）。总RNA链接5′接头和3′接头后经RT-PCR扩增形成小分子RNA的cDNA文库，经6%电泳缓冲液变性胶电泳分离，将长度为47 bp的小分子RNA切胶回收。

1.2.3 高通量测序 cDNA纯化后经Illumina′s Cluster Station生成DNA簇，然后行Illumina GAⅡx测序。通过SCS v2.8软件实时分析测序图片，并使用RTA v1.8.70提取碱基信息。提取的原始序列利用ACGT101-miR v4.2（LC Sciences）软件分析，生成原始数据库。为保证筛选到高质量的基因结果，剔除可比对离列数＜10的基因。最后分析PBC组和对照组之间差异表达的miRNA。

1.2.4 miRNA的靶基因预测 采用软件Miranda和Target Scan在线服务站点输入共同表达的miRNA进行靶基因预测。

1.3 差异表达miRNA的qRT-PCR验证

随机挑选差异表达的miRNA进行验证，根据经验以miR-24为内参照［10］。取3μL总RNA进行反转录，然后取1.5μL cDNA加入20μL的反应体系中。qRT-PCR反应中样本均重复3次，然后于Rotor-gene 3000仪器中完成相应的循环。55℃30 s预变性，95℃2 min变性，经过40个95℃15 s、60℃30 s循环后在65℃溶解。miRNA的表达量用Ct值表示。2组差异表达基因的相对表达量用2－△△Ct表示。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差±s）表示，两组间均数比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本临床参数

测序标本中PBC组与对照组的临床参数见表1。结果显示，PBC组患者的血清总胆红素（TBIL）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）的表达水平明显高于对照组（P均＜0.05）。两组患者的年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组血清相关指标的比较 n＝3，±s

表1 两组血清相关指标的比较 n＝3，±s

组别 平均年龄（岁） TBIL（μmol／L） AST（U／L） ALT（U／L） ALP（U／L） GGT（U／L）对照组 31.67±8.02 12.50±1.08 29.00±6.00 27.00±3.61 54.67±13.05 33.67±7.77 PBC组 56.33±9.61 128.87±21.27 162.00±46.00 124.00±12.17 711.33±47.72 751.67±58.53 t值 －2.425 －9.563 －4.675 －10.778 －20.447 －19.403 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 第2代测序结果分析

经过初级分析后，对照组得到4 691 800条原始序列，去除冗余后剩余881 742条，占总序列18.79%；PBC组测得944 362条原始序列，462 263条可比对序列，占总序列48.95%。对两组可比对数据进行长度分析，显示序列长度主要集中在19 bp，占总数量的38.85%，符合miRNA的长度分布范围。见图1。

2.3 差异表达和新发现miRNA

结果显示，共143条miRNA表达差异有统计学意义，其中PBC组表达上调105条，表达下调38条。已知的有137条，新发现6条，分别为hsa-miR-3665-p5，hsa-miR-3960-p3，hsa-miR-4508-p5，hsamiR-7641-2-p5，hsa-miR-7641-2-p3，PC-3p-755＿3750。比

图1 可比对RNA序列长度分布图

较上述差异序列，差异倍数＞2倍的miRNA有22条，其中，miR-122差异倍数最大，在PBC组中比对照组高8.76倍；其次，miR-34a比对照组高7.26倍，miR-141比对照组高4.98倍；miR-26b是PBC组唯一下调的miRNA，比对照组下调2.49倍。见表2。

表2 两组差异倍数＞2倍的22条m iRNA序列

2.4 miRNA的qRT-PCR验证

选取差异倍数较大的3条miRNA（miR-122，miR-34a，miR-141），分别在20、12、18例PBC患者和20名健康对照标本中进行初步验证。结果显示，miR-122在PBC患者中的表达量明显升高，升高21.24倍（t＝18.06，P＜0.000 1），明显高于测序结果的差异倍数。而miR-141和miR-34a的差异倍数与测序相符，分别为5.51和5.43倍（t＝4.54，P＝ 0.000 8；t＝7.03，P＜0.000 1）。见图2。

图2 m iR-122，m iR-141和m iR-34a表达水平的验证

2.5 靶基因预测

Target Scan human 6.2软件预测结果显示，hasmiR-34a共有655个可能的靶基因；Miranda软件预测has-miR-34a共有1 100个可能的靶基因；Bingo分析显示，靶基因功能涵盖生物过程、细胞组分和分子功能三大类生物功能，部分功能预测见图3。

图3 m iR-34a靶基因生物过程部分预测结果

3 讨论

高通量测序已广泛应用于小RNA或非编码RNA（non-coding RNA）研究领域。相对于miRNA基因芯片而言，miRNA测序有更高的数据通量、更丰富的生物信息学分析，同时，不受数据库和物种的限制，并可检测到多种未知的miRNA。本研究中，首先对PBC组和对照组血清标本进行混合后采取Illumina GAⅡx高通量测序的方法，经过软件分析后发现，PBC组和对照组血清中143条miRNA的表达存在差异。该结果提示外周血清miRNA可作为PBC诊断的分子生物标志物。以往对PBC的诊断主要集中在自身免疫抗体AMA阳性以及肝穿刺病理检查结果阳性。近年来，研究发现miRNA在疾病的诊断方面起着重要作用，尤其在肿瘤的早期诊断［11］、靶向性治疗以及判断预后方面有很大进展［12］。

本研究中检测到一些在肝脏疾病方面有特殊意义的已知miRNA。miR-122是肝脏特异性表达的miRNA，在慢性乙型肝炎［10］、慢性丙型肝炎［13］和原发性肝癌［14］等疾病中均存在差异表达。本研究证实了miR-122在PBC患者外周血中表达明显升高。升高倍数的不同可能是由于研究前后采用的方法不同，测序采用的是混合标本，对年龄、病情相似的患者血清混合后进行高通量检测；而RT-PCR验证是来自于单独扩大血清样本的单一序列检测。因此，我们推测，miR-122的表达量可能受肝脏损伤严重程度的影响，而与引起肝脏损伤致病因素的影响不明显。miR-141属于miR-200家族，在引起器官纤维化方面研究较多。本研究中PBC患者外周血清中miR-141的表达变化也可能与其影响胆管细胞上皮间质表型转变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用有关。另有研究显示，在低氧致肾小管上皮细胞EMT模型中miR-34a表达下降，予以转染miR-34a可有效预防低氧导致的EMT，而抑制miR-34a的表达可促进EMT，同时证实这一作用通过Notch信号通路完成［15］。

本研究综合2种miRNA作用靶基因的结果，推测miRNA在细胞内通过与编码蛋白质的靶基因结合发挥分子生物功能，包括生物过程、细胞组分、分子功能等。但本研究在原始数据方面尚存在一定的不足，如miRNA靶基因预测软件数据有较高的假阳性率、相关生物学知识和基因数据尚不全面等，可能影响分析结果，有待进一步研究。

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A pilot study of serum m icroRNA profiles as a novel biomarker for primary biliary cirrhosis

PAN Teng-li1，2，SUN Li2，ZHOU Xing-bei2，CHEN Li2，YU Xue-jun2，TAN You-wen2
（1.School ofClinicalMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Departmentof Liver Diseases，the Third People′s Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212005，China）

Objective：To screen serum microRNA profiles by high throughput sequencing technology method as diagnostic markers for primary biliary cirrhosis（PBC）.M ethods：First，we employed Illumina GA IIx deep sequencing for the initial screening to indicate the read numbers ofmicroRNAs expression in serum pool of 3 PBC and 3 healthy controls，respectively.Second，qRT-PCR validation study was conducted in more samples.Finally，computer analysiswas conducted to predict target genes and biological functions.Results：Twenty-two miRNAs，whose fold change were greater than 2，were filtered out by high throughput sequencing technology.After qRT-PCR validation，the serum expression levels of miR-122，miR-34a and miR-141 were significantly higher in PBC，consistent with the sequencing results.Target genes of prediction results showed thatmicroRNAs played a role in signal transduction，in the nucleus and cytoplasm，through combined with protein.Conclusion：The distinguishing expressed microRNAs had certain reference value on the diagnosis of PBC.

primary biliary cirrhosis；microRNAs；high-throughput sequencing

R575.22

A

1671－7783（2014）03－0230－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140045

江苏省自然科学基金资助项目（BK2011515）

潘腾莉（1988—），女，硕士研究生；谭友文（通讯作者），主任医师，硕士生导师E-mail：tyw915＠sina.com

2014－03－05 ［编辑］刘星星