MSCs旁分泌对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡的影响

刘玲玲，赵龙，李晓丽，张赢予，王好，周艳芳，张国辉

（江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002）

MSCs旁分泌对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡的影响

刘玲玲，赵龙，李晓丽，张赢予，王好，周艳芳，张国辉

（江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002）

目的：探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）旁分泌因子肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡的影响及其机制。方法：将SD大鼠MSCs传代至第3代后分为未转染组、转染HGF-siRNA组及转染阴性对照（NC）-siRNA组，分别进行相应处理。通过ELISA、蛋白质印迹法检测各组MSCs细胞上清中及细胞中HGF、转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）含量和蛋白表达量。用浓度为1μmol／L的多柔比星处理H9C2细胞4 h后分为4组：单独培养组、MSCs共培养组、与HGF-siRNA-MSCs共培养组及与NC-siRNA-MSCs共培养组。培养24 h后通过流式细胞术AnnexinⅤ／PI双染法检测H9C2细胞凋亡率。结果：HGF-siRNA组MSCs上清中TGF-β1浓度为（519.23±24.34）pg／mL，明显高于未转染组［（459.65±11.78）pg／mL］及NC-siRNA组［（459.33±11.78）pg／mL］（P均＜0.05）；转染HGF-siRNA组MSCs中TGF-β1表达量亦明显高于其他两组。HGF-siRNA-MSCs与H9C2细胞共培养组中H9C2细胞凋亡率为（18.54±0.64）%，较MSCs共培养组［（6.65± 0.49）%］及NC-siRNA-MSCs共培养组［（9.70±1.62）%］明显增加（P均＜0.05）。结论：MSCs旁分泌因子HGF通过抑制TGF-β1的表达对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡起保护作用。

骨髓间充质干细胞；旁分泌；肝细胞生长因子；转化生长因子-β1；细胞凋亡；多柔比星

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一种来源于骨髓间质的多功能干细胞，具有向多种细胞分化的潜能。最初对其在心脏疾病方面的研究侧重于MSCs向心肌细胞的分化，但越来越多的文献报道，MSCs向心肌细胞分化的数量极少［1］，不足以解释其对心脏功能的恢复作用，且发现MSCs可分泌较多的细胞因子［2］。目前已被确认的细胞因子包括肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），胰岛素样生长因子，基质细胞衍生因子，血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等近40种。HGF具有抗心肌细胞凋亡、促进血管再生的作用。TGF-β1在心脏损伤、修复以及心脏重构中起着关键作用。TGF-β1除了促进心肌肥大和纤维化，还能导致心肌细胞凋亡［3］。

本课题组在近几年的研究中初步探讨了HGF对多柔比星诱导的心肌细胞凋亡有明显的保护作用［4］。相反，TGF-β1能促进心肌细胞的凋亡［5］，而通过抑制MSCs中TGF-β1的表达，能显著降低多柔比星诱导的心肌细胞凋亡率。在前期研究结果的基础上，我们设想HGF对心肌细胞的保护作用除了直接抑制细胞凋亡外，是否会抑制MSCs分泌TGF-β1呢？

本实验通过转染siRNA，从后转录水平抑制MSCs中HGF的表达，观察MSCs旁分泌因子对多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

4～6周龄SD大鼠，由江苏大学实验动物中心提供［实验动物许可证号：SYXK（苏）2008－0024］。H9C2细胞株购于中国科学院上海细胞库。

盐酸多柔比星购自美国Enzo公司；HGF-siRNA由上海吉玛公司设计并合成；大鼠HGF、TGF-β1ELISA试剂盒购自上海奇康生物科技公司；兔抗大鼠HGF-IgG购自美国Santa Cruz公司，兔抗大鼠TGF-β1-IgG、GAPDH-IgG、山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；eECL高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物技术有限公司；AnnexinⅤ／PI双染凋亡试剂盒购自南京厚载生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠原代MSCs的分离和培养 颈椎脱臼法处死大鼠，取出双侧股骨和腓骨并显露骨髓腔。用5 mL注射器抽取无血清DMEM-F12冲洗骨髓腔。将收集的细胞悬液过滤、离心，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEF-F12重悬细胞，以107／mL密度接种于10 cm培养皿，置于培养箱中培养。待细胞融合达80%～90%时进行首次传代培养。取培养至第3代的MSCs用于后续实验。

1.2.2 H9C2细胞的培养 将H9C2细胞株以107／mL细胞密度接种于10 cm培养皿后置于培养箱中培养。待细胞达80%～90%融合时以1∶2传代培养。

1.2.3 MSCs siRNA转染方法 转染前1天将第3代MSCs以2×104／mL的密度接种到6孔板中继续培养。次日，待细胞融合达70%～80%，取HGF-siRNA稀释液2μL于EP管中，加入200μL无血清的DMEM-F12混匀。取Lipofectamine 2000脂质体转染试剂5μL，加入250μL DMEM-F12培养基混匀后室温下孵育5 min。将以上两种液体混匀后室温下孵育20 min，再重新接种到6孔板中，加入1 550μL无血清的DMEM-F12培养基，混匀后置于CO2培养箱中继续培养。12 h后换为含10%血清的DMEM-F12培养，24 h后荧光电子显微镜下观察转染效率，并收集上清及细胞进行后续试验。

1.2.4 MSCs与H9C2细胞共培养

1.2.4.1 H9C2细胞多柔比星损伤模型的建立取H9C2细胞悬液，每孔2 mL加入到30 mm共培养插件Millicell装置中，置于培养箱中预培养48 h。用终浓度为1μmol／L的多柔比星处理4 h，建立多柔比星损伤模型，更换为含 10%血清的DMEM-F12。

1.2.4.2 转染MSCs 将第3代MSCs按2×105／mL接种于6孔板中，24 h后分为未转染组，转染HGF-siRNA组及转染阴性对照（NC）-siRNA组，继续培养24 h。

1.2.4.3 建立MSCs与H9C2细胞共培养体系 将接种有H9C2细胞的Millicell装置插入预先接种有MSCs的6孔板中，建立两种细胞非直接接触式的共培养体系。共分为4组：单独H9C2细胞培养组、与MSCs共培养组、与HGF-siRNA-MSCs共培养组及与NC-siRNA-MSCs共培养组。

1.2.5 ELISA法检测细胞上清HGF及TGF-β1含量

转染成功后收集各组细胞上清液，按ELISA试剂盒操作说明加入适量标准品及样品、检测抗体、底物及终止液。酶标仪检测各孔光密度值，根据标准曲线计算各组细胞上清中HGF及TGF-β1的质量浓度。

1.2.6 蛋白质印迹法检测HGF及TGF-β1的相对表达量 MSCs转染siRNA 24 h后加入细胞裂解液与PMSF的混合液体，40 min后吸取裂解液，4℃12 000 r／min离心20 min，吸取上清。取等蛋白含量的样品上样。恒压80 V电泳约30min后提高电压至110 V。80 V恒压下4℃转膜2 h。室温下5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入相应的一抗（HGF稀释浓度为1∶800，TGF-β1、GADPH稀释浓度为1∶1 000），4℃过夜孵育。次日用HRP标记的二抗（稀释浓度均为1∶10 000）室温下孵育1 h。洗膜后加入eECL显色液，用Bio-Rad凝胶成像仪扫描拍摄蛋白条带，测定各条带灰度值，并以GAPDH为参照，计算和分析结果。

1.2.7 流式细胞术AnnexinⅤ／PI双染法检测H9C2细胞凋亡率 吹打各组Millcell膜上的H9C2细胞，离心后收集细胞至Ep管中，用PBS洗涤细胞2次。各组分别加入结合缓冲液500μL混匀悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 5μL避光反应，再加入PI 10μL避光4℃孵育5 min，流式细胞仪检测分析。以AnnexinⅤ（＋）／PI（－）、AnnexinⅤ（＋）／PI（＋）两个象限的细胞比例之和作为凋亡率。

1.3 统计学处理

使用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差（±s）表示，重复测量资料采用一般线性模型方差分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠MSCs的形态

MSCs悬液接种24 h后在电子显微镜下观察，细胞开始贴壁生长。换液后可见贴壁的MSCs呈梭形或不规则形，单个或片状生长。继续培养3～5 d后，贴壁细胞呈明显的细胞集落，呈漩涡状分布。传代后，细胞形态较均一，呈长梭形，为纤维样细胞外观。传至第3代时，细胞形态较稳定。见图1。

2.2 H9C2细胞形态

培养3 d的H9C2细胞呈长梭形，胞质丰富，折光度好。见图2。

2.3 HGF-siRNA转染MSCs的效率

HGF-siRNA转染24 h后，荧光电子显微镜下计算绿色荧光细胞所占比例，显示MSCs的转染效率可达（75.46±3.36）%。见图3。

图1 第3代骨髓间充质干细胞（倒置显微镜×200）

图2 H9C2细胞形态（倒置显微镜×200）

图3 转染HGF-siRNA的MSCs形态（荧光电子显微镜×200）

2.4 各组MSCs上清中HGF及TGF-β1含量

与未转染组比较，转染HGF-siRNA后的MSCs上清中的HGF含量明显下降，而TGF-β1含量却明显增加，见表1。

表1 各组M SCs上清中HGF、TGF-β1的含量

2.5 各组MSCs中HGF及TGF-β1的表达量

提取各组细胞蛋白，用蛋白质印迹法检测HGF及TGF-β1的表达量。转染HGF-siRNA后的MSCs两种旁分泌因子的表达量与细胞上清中检测结果一致。见图4－图6。

图4 蛋白质印迹法检测各组MSCs旁分泌因子的表达

2.6 各组H9C2细胞的凋亡率

流式细胞术分析结果显示，单独培养的H9C2细胞凋亡率为（19.39±0.17）%，与MSCs共培养组为（6.65±0.4）%，与HGF-siRNA-MSCs共培养组为（18.54±0.64）%，与NC-siRNA-MSCs共培养组为（9.70±1.62）%。与HGF-siRNA-MSCs共培养24 h后的H9C2细胞凋亡率较与未转染的MSCs共培养组及NC-siRNA-MSCs共培养组H9C2细胞凋亡率均明显增加（P均＜0.05），但较H9C2单独培养组细胞凋亡率下降（P＜0.05）。见图7。

图5 各组MSCs中HGF的表达

图6 各组MSCs中TGF-β1的表达

图7 流式细胞术检测各组H9C2细胞的凋亡率

3 讨论

MSCs作为一种多功能分化的干细胞，已被广泛应用于心脏疾病的治疗。近年来，旁分泌机制在其中的作用越来越受到重视。已发现的MSCs旁分泌细胞因子有40余种，其可能作用机制包括血管生成、抑制心肌细胞的凋亡、抑制炎性反应等［6］。

然而，大多研究都是针对单个因子的作用机制，在旁分泌细胞因子的微环境中，各因子间是否存在着相互作用呢？Kelly等［7］研究发现，肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor type 1，TNFR1）通过减少MSCs的旁分泌途径而削弱MSCs对心肌细胞的保护作用。Jayasankar等［8］研究表明，HGF可通过促进新生血管的生成和抑制心肌细胞的凋亡对心肌梗死后的心脏起修复作用。

我们的实验结果显示，转染HGF-siRNA的MSCs中HGF的表达量较未转染组及阴性对照组均明显下降，表明转染模型构建成功。在HGF表达量减少的同时，发现TGF-β1的表达量与HGF呈相反趋势。这一结果表明，MSCs旁分泌因子HGF对TGF-β1有抑制作用。

此外，本实验采用Millicell装置建立MSCs与多柔比星损伤的H9C2细胞的非直接接触式共培养体系，保证MSCs旁分泌的各种细胞因子可以对H9C2细胞产生生物学影响。共培养24 h后采用流式细胞术AnnexinⅤ／PI双染法检测H9C2细胞凋亡率。结果显示，与HGF-siRNA-MSCs共培养24 h后，H9C2细胞凋亡率较与未转染的MSCs共培养组及NC-siRNA-MSCs共培养组H9C2细胞凋亡率明显增加（P＜0.05），但较H9C2单独培养组细胞凋亡率下降（P＜0.05）。这一结果证实了MSCs旁分泌HGF抑制多柔比星诱导的H9C2细胞凋亡作用的机制不仅与HGF本身对细胞凋亡的保护作用有关，还与其对TGF-β1的抑制作用密切相关。

综上所述，MSCs旁分泌作用对多柔比星诱导的H9C2细胞损伤的修复作用除了众多对细胞有保护作用的旁分泌因子外，细胞因子间的相互作用在其中也起到了至关重要的作用。这一实验结果启迪我们，在研究MSCs旁分泌机制时，应将所形成的修复微环境看作一个整体，既研究各个旁分泌因子的单独作用机制，也要注意发现因子间的相互作用，这样才能更透彻地了解其机制，从而可通过抑制或促进某些旁分泌因子的表达而减少副效应、提高移植安全性，使旁分泌的微环境能极大地发挥对心肌细胞的修复作用。

［1］ Nakamura Y，Wang XV，Xu C，et al.Xenotransplantation of long-term-cultured swine bonemarrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2007，25（3）：612－620.

［2］ Gnecchi M，Zhang Z，Ni A，et al.Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy［J］.Circ Res，2008，103（11）：1204－1219.

［3］ Bujak M，Ren G，Kweon HJ，et al.Essential role of Smad3 in infarct healing and in the pathogenesis of cardiac remodeling［J］.Circulation，2007，116（19）：2127－2138.

［4］ 郭俊芳，张赢予，陈蓉，等.骨髓间充质干细胞旁分泌途径与阿霉素损伤心肌细胞凋亡：怎样证明其一直效应？［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（10）：1755－1759.

［5］ 陈星，潘建业，周艳芳，等.转化生长因子-β1在多柔比星致大鼠心肌细胞凋亡中的促进作用［J］.江苏大学学报：医学版，2012，22（1）：46－50.

［6］ Angoulvant D，Ivanes F，Ferrera R，et al.Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury［J］.J Heart Lung Transplant，2011，30（1）：95－102.

［7］ Kelly ML，Wang M，Crisostomo PR，et al.TNF receptor 2，not TNF receptor 1，enhances mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection following acute ischemia［J］.Shock，2010，33（6）：602－607.

［8］ Jayasankar V，Woo YJ，Bish LT，et al.Gene transfer of hepatocyte growth factor attenuates postinfarction heart failure［J］.Circulation，2003，108（suppl 1）：Ⅱ230Ⅱ236.

Effect of hepatocyte grow th factor on doxorubicin-induced H9C2 cells apoptosis

LIU Ling-ling，ZHAO Long，LIXiao-li，ZHANG Ying-yu，WANG Hao，ZHOU Yan-fang，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the effect of hepatocyte growth factor（HGF）on doxorubicin（DOX）-induced H9C2 cells apoptosis.M ethods：The third generation ofmesenchymal stem cells（MSCs）were divided into three groups：cultured alone，HGF-siRNA-MSCs and NC-siRNA-MSCs.The concentration of HGF and transforming growth factorβ1（TGF-β1）weremeasured with both ELISA and Western-blot kit.H9C2 cellswere exposed to 1.0μmol／L doxorubicin for 4 hours.Then they were divided into four groups：cultured alone，co-cultured with MSCs，co-cultured with HGF-siRNA-MSCs and co-cultured with NC-siRNAMSCs.After 24 hours，the apoptosis rate was determined by flow cytometry（FCM）.Results：Compared with other groups，the concentration of TGF-β1in MSCs were significantly increased in the HGF-siRNAMSCs［（519.23±24.34）pg／mL］than cultured alone［（459.65±11.78）pg／mL］and NC-siRNA-MSCs［（459.33±11.78）pg／mL，P＜0.05］.The apoptosis rate of H9C2 cells was increased significantly in cocultured with HGF-siRNA-MSCs（18.54±0.64）%than co-cultured with MSCs（6.65±0.49）%and NC-siRNA-MSCs［（9.70±1.62）%，P＜0.05］.Conclusion：HGF prevented DOX-induced H9C2 cells apoptosis by inhibition of TGF-β1.

mesenchymal stem cells；paracrine；hepatocyte growth factor；transforming growth factor β1；apoptosis；doxorubicin

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0221－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140033

刘玲玲（1988—），女，硕士研究生；张国辉（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：13338812776＠189.cn

2014－02－20 ［编辑］陈海林