薯蓣皂苷元对人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞生物学行为的影响

吴媛媛，崔国兴，马铁梁，丁伟良，葛志军，唐志安

（江苏大学附属宜兴医院1.消化内科，2.中心实验室，3.重症医学科，4.中医科，江苏宜兴214200）

薯蓣皂苷元对人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞生物学行为的影响

吴媛媛1，崔国兴1，马铁梁2，丁伟良2，葛志军3，唐志安4

（江苏大学附属宜兴医院1.消化内科，2.中心实验室，3.重症医学科，4.中医科，江苏宜兴214200）

目的：观察薯蓣皂苷元对人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡过程的影响并探讨其机制。方法：采用薯蓣皂苷元处理体外培养的BGC-823和SGC-7901细胞，用MTT法、Transwell实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。用免疫印迹法检测BGC-823和SGC-7901细胞中凋亡相关蛋白BAX、凋亡抑制基因Bcl-2和MAPK信号通路的Erk1／2、JNK、p38三个通路中相关蛋白的表达。结果：经薯蓣皂苷元处理后，BGC-823和SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低，凋亡相关蛋白BAX明显升高，Bcl-2的表达明显降低；p-p38表达水平明显降低，但JNK、p-JNK、Erk1／2、p-Erk1／2和p38的表达无明显变化。结论：薯蓣皂苷元可能通过MAPK通路中的p-p38通路影响人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞的生物学行为。

薯蓣皂苷元；胃癌细胞；MAPK通路

胃癌发病年龄逐年趋于年轻化，死亡率在全球排第2位，且具有明显的地域性，中日韩为高发区［1－3］。目前应用中医药治疗胃癌被广泛关注，中药能缓解各种类型胃癌的临床症状，减轻放、化疗的不良反应，提高治疗率，延长患者的生存时间。MAPK信号通路是常见的细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡相关信号转导通路的汇集点，在造血系统肿瘤、上皮性肿瘤、绒癌等的发生发展中发挥着重要的作用［4－5］。

菝葜，别名金刚藤，菝葜属，有祛风利湿、消肿解毒、抗炎镇痛等药理活性。薯蓣皂苷元是菝葜中主要的活性成分［6－7］。为了解薯蓣皂苷元是否对胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡能力起作用，并进一步探讨这一作用是否与MAPK信号通路有关，我们观察了薯蓣皂苷元处理后人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡能力的变化，旨在为胃癌治疗寻找不良反应少，具有更好治疗效果的天然抗癌植物药提供线索。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞由南京医科大学周建伟教授馈赠；胎牛血清购自杭州四季青公司；双抗（含青霉素10万U／L、链霉素100mg／L的青链霉素）购自南通碧云天公司；RPMI 1640培养基（Hyclone公司）；Transwell小室、基质胶（美国BD公司）；兔抗人JNK、p-JNK、Erk1／2、p-Erk1／2、p38、pp38抗体（美国Cell Signaling公司）；兔抗人Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和B细胞白血病／淋巴瘤相关蛋白（B cell leukemia／lymphoma 2，Bcl-2）抗体（英国Abcam公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自碧云天公司；薯蓣皂苷元购于Sigma-Aldrich公司（货号：S8534-25MG）。

1.2 细胞培养

人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞，用含10%胎牛血清和双抗（含青霉素10万U／L、链霉素100 mg／L的青链霉素）的RPMI 1640培养基置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，胰酶消化传代。

1.3 MTT法检测两种胃癌细胞增殖能力

取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，将细胞以1×105／孔的密度接种于96孔板，每孔设5个复孔，等贴壁后，加入质量浓度分别为6.25、12.5、25、50μg／mL的薯蓣皂苷元（药物组），并设阴性对照组（只有培养液，无薯蓣皂苷元），分别培养24、48、72 h，开始MTT反应，570 nm波长下检测光密度（D）值。根据D值绘制细胞生长曲线，比较处理前后细胞生长速度的变化。

1.4 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭和迁移力

在24孔板的Transwell小室加基质胶100μL，铺于培养小室滤膜上制作人工基底膜（无基底膜测迁移能力，有基底膜测侵袭能力），将100μL密度为2×105／mL的细胞悬液加入上室，600μL含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基加入下室。培养箱中分别孵育24、48、72 h后进行Giemsa染色，200倍光镜下随机选择9个视野计数穿膜细胞数。

1.5 蛋白质印迹法检测凋亡及MAPK信号通路代表性蛋白的表达

取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，将细胞以1×105／孔的密度接种于6孔板。待细胞贴壁后，加入薯蓣皂苷元使其终质量浓度为50 μg／mL。提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，随后电泳，湿法转膜，一抗使用BAX、Bcl-2、Erk1／2、JNK、p38、p-Erk1／2，p-JNK，p-p38抗体，二抗使用AP标记的碱性磷酸酶，ECL显影，底片扫描仪拍照。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 薯蓣皂苷元对胃癌细胞增殖能力的影响

薯蓣皂苷元作用于BGC-823和SGC-7901细胞24、48、72 h后，用MTT法检测细胞增殖能力。从图1可见，随薯蓣皂苷元质量浓度的增大，细胞增殖能力逐渐下降，差异有统计学意义（P＜0.05），但各时间点间差异无统计学意义。

2.2 薯蓣皂苷元对胃癌BGC-823和SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，经50μg／mL薯蓣皂苷元处理后，药物组胃癌BGC-823和SGC-7901细胞穿膜细胞数明显减少，即迁移及侵袭能力明显降低，与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.3 薯蓣皂苷元对胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

薯蓣皂苷元处理胃癌BGC-823和SGC-7901细胞后，蛋白质印迹法检测结果发现，薯蓣皂苷元处理后的BGC-823和SGC-7901细胞的BAX蛋白表达明显增强（P＜0.01），而Bcl-2蛋白的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 MAPK 3条通路代表性蛋白磷酸化和非磷酸化的表达

对MAPK 3条通路的代表性蛋白进行免疫印迹分析，结果发现经薯蓣皂苷元处理后，两种胃癌细胞中p-p38的表达明显下降（P＜0.05，图4），而其非磷酸化水平（p38）无明显变化，且其他两条通路JNK和Erk1／2以及磷酸化的JNK和Erk1／2亦无明显变化（图4）。

图1 不同质量浓度薯蓣皂苷元处理后BGC-823和SGC-7901细胞的生长曲线

图2 薯蓣皂苷元对BGC-823和SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响

图3 薯蓣皂苷元处理后BGC-823和SGC-7901细胞BAX蛋白和Bcl-2蛋白的表达

图4 薯蓣皂苷元处理后MAPK通路中各通路蛋白表达水平

3 讨论

薯蓣皂苷元等中药提取物已广泛应用于妇科慢性炎症的治疗以及调节免疫、活血化瘀、抗肿瘤等［8－11］。本实验使用薯蓣皂苷元对胃癌细胞进行处理，发现其对胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭能力有一定的影响。

研究发现薯蓣皂苷元有抗肿瘤活性，对肝癌SMMC-7721、胃腺癌MGC-803、人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用强于长春新碱（VCR）［12］。另外，有研究发现其对胃癌BGC-823细胞的增殖有抑制作用，并可诱导细胞凋亡［13］。我们的实验结果同样显示薯蓣皂苷元对BGC-823和SGC-7901细胞有相似的影响。

MAPK信号通路与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡密切相关，对肿瘤的生长增殖起至关重要的作用［14］。在真核细胞中，主要有Erk1／2、JNK、p38等通路，调节细胞增殖、分化、发育、凋亡及炎症反应等［15］。实验表明，抑制p38或ERK1／2均可抑制胃癌MGC-803细胞的体外生长与迁徙［16］。另外p38信号传导通路参与胃癌的发生，而且其表达水平还与胃癌的恶性程度呈正相关［17－18］。使用MEK抑制剂PD98059可以抑制肝癌细胞Ras-MAPK信号转导［19］。在薯蓣皂苷元处理后的食管癌细胞中，pp38蛋白的表达水平明显降低［20］。本研究中薯蓣皂苷元处理后的胃癌细胞中，p-p38蛋白表达水平明显降低，而p38和其他两条通路JNK和Erk1／2的表达无明显变化，提示在胃癌中，薯蓣皂苷元可能通过p38通路的磷酸化激活起作用，从而调节BGC-823和SGC-7901细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。

综上所述，薯蓣皂苷元在胃癌BGC-823和SGC-7901细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中可能是通过p38通路起作用。这将为寻找新的治疗胃癌的天然抗癌药提供一定的线索。

［1］ 周云，赵丹.胃癌内科治疗现状［J］.郑州大学学报：医学版，2009，44（5）：938－942.

［2］ 秦叔逵，龚新雷.晚期胃癌化疗的现状和新进展［J］.临床肿瘤学杂志，2006，11（9）：641－652.

［3］ 孙秀娣，牧人，周有尚，等.中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测［J］.中华肿瘤杂志，2004，26（1）：4－9.

［4］ Kyriakis JM，Avruch J.Sounding the alarm：Protein kinase cascades activated by stress and inflammation［J］.J Biol Chem，1996，271（40）：24313－24316.

［5］ Zhang XQ，Zhao XS，Pang ZJ，etal.Role of p38 pathway in PMA-induced in vitro invasion of JAR human choriocarcinoma cell line［J］.Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2003，23（8）：792－794.

［6］ 聂凌，鸿林淑，英宁正.薯蓣属植物中薯蓣皂苷元的研究进展［J］.中国生化药物杂志，2004，25（5）：318－320.

［7］ 张莲萍，于国平，刘焱文.不同产地菝葜不同部位薯蓣皂苷元的含量比较［J］.湖北中医学院学报，2007，9（3）：50－51.

［8］ 陈东生，吕永宁，王杰.菝葜的抗炎作用［J］.中国医院药学杂志，2000，20（9）：544－545.

［9］ 吕永宁，陈东生，付磊，等.菝葜三种提取物活血化瘀药理作用研究［J］.中国药科大学学报，2001，32（6）：448－450.

［10］ 陈东生，华小黎.菝葜的研究现状［J］.中药材，2006，29（1）：90－93.

［11］ 文朝阳，丰平，丁相海，等.复方菝葜抑瘤机理的实验研究［J］.北京中医，2001（4）：44－45.

［12］ 李忌，陈俊杰，巨勇，等.天然甾体皂苷化合物的抗肿瘤活性［J］.天然产物研究与开发，1996，11（1）：14－17.

［13］ 廖子君，张晓明，郭亚焕，等.菝葜皂苷元对胃癌BGC-823细胞增殖、凋亡影响的实验研究［J］.现代肿瘤医学，2010，18（6）：1085－1087.

［14］ Johnson GL，Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathwaysmediated by ERK，JNK，and p38 protein kinases［J］.Science，2002，298（5600）：1911－1912.

［15］ Lawrence MC，Jivan A，Shao C，et al.The roles of MAPKs in disease［J］.Cell Res，2008，18（4）：436－442.

［16］ 宋婷阁，摆茹，黄菱，等.抑制MAPK信号通路对胃癌细胞MGC-803生长迁徙的影响［J］.宁夏医科大学学报，2013，35（6）：631－634.

［17］ 邓立力，邓洪滨，吕慧芳，等.STAT3和p38在胃癌组织中的表达及意义［J］.中国肿瘤临床，2008，35（4）：202－205.

［18］ 费正华，姜藻.蛋白酶体抑制剂DCI对胃癌细胞P38α信号的调节［J］.实用医学杂志，2008，22（4）：322－325.

［19］ 宋霆婷，姜玉华，李妙玉，等.PD98059对肝癌细胞Ras-MAPK信号转导的作用［J］.实用医学杂志，2005，21（5）：446－448.

［20］ 林杰，谈永飞，马铁梁，等.薯蓣皂苷元通过MAPK通路对食管癌细胞Eca109的调控［J］.世界华人消化杂志，2013，21（35）：3977－3982.

Diosgenin affect human gastric cancer BGC-823 and SGC-7901 cells through MAPK pathways

WU Yuan-yuan1，CUIGuo-xing1，MA Tie-liang2，DINGWei-liang2，GE Zhi-jun3，TANG Zhi-an4
（1.Department of Gastroenterology，2.Central Laboratory，3.Department of Critical Care Medicine，4.Department of Traditional Chinese Medicine，the Affiliated Yixing Hospital of Jiangsu University，Yixing Jiangsu 214200，China）

Objective：To discuss the role of diosgenin in the proliferation，invasion，migration and apoptosis of human gastric cancer BGC-823 and SGC-7901 cells via MAPK signaling pathways.M ethods：Human gastric cancer cell lines BGC-823 and SGC-7901 were cultured in vitro and treated with diosgenin.Proliferation rate，cellmigration and invasion weremeasured by MTTmethod via Transwell assay.And protein expression of apoptosis-associated protein（AAP）BAX，apoptosis inhibitor protein Bcl-2 and Erk1／2，JNK and p38 proteins of MAPK pathways were measured by Western Blot.Results：When BGC-823 and SGC-7901 cellswere treated with diosgenin，the proliferation，migration and invasion of BGC-823 and SGC-7901 cellswere significantly decreased.The apoptosis of both cellswas enhanced to a certain extent.As to the correlation of gastric cancer cells and MAPK pathways，we found that p-p38 protein expression level after diosgenin treated was dramatically down-regulated；however，the expression levels of Erk1／2，JNK，p38，p-Erk1／2 and p-JNK were negligible.Conclusion：Diosgenin might affect the proliferation，invasion，migration and apoptosis of human gastric cancer BGC-823 and SGC-7901 cells through p-p38 ofMAPK pathways.

diosgenin；gastric cancer cells；MAPK pathways

R541.75

A

1671－7783（2014）03－0207－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140037

吴媛媛（1986—），女，江苏宜兴人，医师，主要从事胃肠肿瘤研究。

2014－02－27 ［编辑］ 陈海林