siRNA沉默FANCD2基因增加肺癌A549／DDP细胞对顺铂化疗的敏感性

姜贺果，戴春华，李坚，陈永昌，蓝婷，伍敏

（1.江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江212001；2.江苏大学基础医学研究所，江苏镇江212013）

siRNA沉默FANCD2基因增加肺癌A549／DDP细胞对顺铂化疗的敏感性

姜贺果1，戴春华1，李坚1，陈永昌2，蓝婷2，伍敏2

（1.江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江212001；2.江苏大学基础医学研究所，江苏镇江212013）

目的：研究siRNA沉默FANCD2基因后人肺腺癌A549／DDP耐药细胞株对顺铂（DDP）耐药性的变化。方法：合成针对FANCD2基因的siRNA（FANCD2-siRNA），采用脂质体将其分别转染肺癌A549细胞株和A549／DDP耐药细胞株。CCK-8法测定经DDP处理的A549和A549／DDP细胞株转染siRNA前后的细胞增殖率变化；免疫印迹法测定2种细胞株转染siRNA前后FANCD2蛋白单泛素化水平；免疫荧光测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成。结果：经DDP处理的A549／DDP细胞增殖率，FANCD2蛋白单泛素化水平及核聚小体形成程度明显高于A549细胞。转染FANCD2-siRNA后，A549和A549／DDP细胞的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成明显降低，细胞增殖率显著下降。结论：应用siRNA转染技术沉默FANCD2基因可抑制FA／BRCA途径的DNA修复功能，从而增加肺癌细胞对DDP的敏感性，部分逆转耐药肺癌细胞株对DDP的耐药性。

肺癌细胞；顺铂；耐药性；FA／BRCA途径；FANCD2；siRNA

肺癌在世界范围内的发病率和病死率均居各种恶性肿瘤的首位。顺铂（DDP）是肺癌各种化疗方案中的基本药物，其作用机制是结合于DNA链，致其双链交联和断裂，阻滞其复制和转录，进而引起细胞损伤和凋亡。DDP具有抗癌谱广、抗癌作用强等特点，但其日益增高的肿瘤耐药性和毒副作用限制了临床的广泛应用。既往研究显示，肿瘤细胞对DDP耐药包含多种机制：铜转运蛋白CTR1表达下降；谷胱甘肽解毒作用增强；细胞表面P-糖蛋白多药耐药转运体表达升高；细胞DNA损伤修复功能增强，包括核苷酸切除修复（NER）、碱基切除修复（BER）、同源重组修复（HRR）、非同源末端连接（NHEJ）修复等［1－2］。近来研究发现，FA／BRCA途径参与肿瘤细胞对DDP的耐药。

范可尼贫血症（Fanconi anemia，FA）是一种以多发性先天畸形，进行性骨髓衰竭，高度肿瘤易感性为特点的罕见遗传性疾病，患者体细胞FA／BRCA途径均有不同类型的基因突变，表现为对DNA交联剂类化疗药物极为敏感［3］。作为机体修复DNA损伤的的信号通路之一，完整的FA途径在DNA交联损伤的修复中发挥重要作用［4］。目前已证实FA蛋白至少由13个FA互补基因编码（FANC-A，B，C，D1，D2，E，F，G，I，J，L，M，N），其中D2编码该途径核心蛋白FANCD2。FANCD1（即BRCA2）、J、N为下游基因，其余为上游基因［4－5］。上游基因的转录产物和3种FA相关蛋白组成FA核心复合体，其主要功能是单泛素化FANCD2和FANCI［6－7］，这一核心过程是BRCA1依赖性的，因此FA途径又称为FA／BRCA途径。FANCD2蛋白经泛素化后，从相对分子质量为155 000的小片段（S），修饰为162 000的大片段（L）［8］，两者之比（L／S）反应FANCD2蛋白单泛素化水平。

本实验采用siRNA转染技术沉默肺癌细胞株FA／BRCA途径关键基因FANCD2，通过观察肺癌细胞株对DDP敏感性的变化，研究FANCD2蛋白在肺癌细胞对DDP耐药中的作用，探讨通过抑制FA／BRCA途径中FANCD2基因的表达逆转A549／DDP细胞株对DDP耐药性的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

非小细胞肺癌细胞株（A549、A549／DDP）购自中国科学院上海生命科学研究院；高糖DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司；DDP购自江苏豪森制药有限公司；siRNA套装购自广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；DMSO、Triton X-100购自美国Sigma公司；β-肌动蛋白、FANCD2蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司；低聚甲醛、羊抗小鼠二抗、CY3荧光标记羊抗鼠二抗购自北京康为世纪公司；PVDF膜，牛血清白蛋白（BSA）购自瑞士Roche公司；ECL发光剂购自美国Millipore公司；DAPI购自美国Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549、A549／DDP细胞株置于含10%热灭活胎牛血清、青霉素（100 U／mL）、链霉素（100μg／mL）的DMEM中，A549／DDP培养基中加入终质量浓度为1μg／mL的DDP，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育。

1.2.2 siRNA转染 将对数生长期的A549、A549／DDP细胞接种于6孔板，每孔1×106个细胞。培养12 h后换用无血清培养基饥饿12 h。siRNA转染浓度为50 nmol／L。按照siRNA试剂盒说明书，将含FANCD2-siRNA的LipofectamineTM2000与siRNA储存液各5μL分别溶于250μL不含抗生素的无血清DMEM中，室温孵育5 min。轻摇混匀转染试剂与siRNA储存液，室温孵育20 min后，加入培养板中，培养基终体积为2 mL。转染6 h后，换用含10%胎牛血清的DMEM继续培养。

1.2.3 CCK-8法测定细胞增殖率 取对数生长期、经FANCD2-siRNA转染成功前后的A549、A549／DDP细胞，消化离心后接种于96孔板中，每孔细胞2×103个，培养24 h，将DDP质量浓度梯度分别为0、1.25、2.5、5、10、20μg／mL的系列培养基100μL分别加入对应的孔，其中0μg／mL为阴性对照组，同时设立空白孔（含培养基不含药物与细胞）进行校正，每组样本6个复孔。分别培养24、48 h后，于对应孔加入CCK-8试剂10μL，继续培养1 h。酶标仪450 nm波长下检测各孔光密度（D）值。细胞增殖率＝［（D实验组－D空白孔）／（D阴性对照组－D空白孔）×100%。实验重复3次。

1.2.4 蛋白质印迹法检测肺癌细胞FANCD2蛋白的表达 取对数生长期、经FANCD2-siRNA转染成功前后的A549、A549／DDP细胞接种于6孔板，每孔2.5×106个细胞，培养24 h。经含DDP质量浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20μg／mL的培养基2 mL处理24、48 h后，弃培养基，用预冷PBS洗2遍，加入煮沸的2×SDS上样缓冲液100μL，收集细胞总裂解物，100℃煮沸5 min，超声破碎1 min，4℃，12 000×g离心10 min。将蛋白样品行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。一抗鼠抗人FANCF单克隆抗体（1∶100）、鼠抗人FANCD2单克隆抗体（1∶200）4℃孵育过夜。二抗羊抗鼠IgG（1∶2 000）室温孵育1 h，β-肌动蛋白（1∶10 000）室温孵育1 h。ECL发光剂显色，Typhoon分子成像系统分析灰度，以FANCD2／β-肌动蛋白比值表示FANCD2蛋白的相对含量。实验重复3次。

1.2.5 免疫荧光法检测FANCD2核聚小体表达取经FANCD2-siRNA转染成功前后的对数生长期A549、A549／DDP细胞，每孔5×105个细胞。设空白培养组，每组3个复孔，培养24 h。5μg／mLDDP分别处理24、48 h，PBS洗2遍；每孔加入200μL 4%低聚甲醛，固定细胞30 min，PBS洗30 min；300μL 0.3%Triton X-100透膜作用20 min，PBS洗30min；500μL 3%BSA室温孵育1 h，PBS洗30 min；200 μL FANCD2一抗4℃过夜，PBS洗15 min；荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS避光洗15 min；DAPI染核20 min，PBS暗处洗15 min；荧光显微镜下观察荧光强度。实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 DDP对A549和A549／DDP细胞株转染前后的增殖抑制作用

A549和A549／DDP细胞株转染FANCD2-siRNA24 h和48 h后，IC50均较转染前明显降低（P均＜0.05）。见表1。

FANCD2-siRNA转染前，除1.25μg／mL DDP外，其他质量浓度DDP处理后的A549／DDP细胞增殖率在24 h和48 h均明显高于A549细胞（P均＜0.05）。FANCD2-siRNA转染后，经DDP处理的A549／DDP细胞增殖率在24 h和48 h也明显高于A549细胞（P均＜0.05）。此外，A549和A549／DDP细胞增殖率在FANCD2-siRNA转染后24 h和48 h均分别低于其siRNA转染前（P均＜0.05）。结果表明，2种肺癌细胞株转染FANCD2-siRNA前后的细胞增殖率均随DDP质量浓度的增高而降低，呈剂量依赖性；同时，随DDP作用时间的延长而降低，呈时间依赖性。见图1。

图1 FANCD2-siRNA转染前后DDP抑制肺癌细胞增殖率的剂量 效应曲线与时间 效应曲线

表1 siRNA转染前后肺癌细胞经DDP处理后的IC50 μg／m L

2.2 FANCD2-siRNA转染前后肺癌细胞FANCD2单泛素化水平

A549细胞经梯度DDP处理24 h和48 h后，FANCD2蛋白长短片段之比（L／S）随DDP质量浓度升高而降低，与0μg／mL比较差异有统计学意义（P＜0.05），仅在20μg／mL DDP处理24 h后L／S较0μg／mL增加（P＜0.05，图2A）。

A549／DDP经梯度DDP处理24 h和48 h后L／S随DDP质量浓度升高而升高，除在2.5μg／mL DDP处理24 h后L／S比值较0μg／mL降低外（t＝4.327，P＝0.049），其余各质量浓度DDP处理24 h和48 h后FANCD2蛋白总量及L／S比值较0μg／mL明显升高（P均＜0.05，图2B），表明FANCD2单泛素化水平增高。

经FANCD2-siRNA转染后，除A549／DDP细胞经5μg／mL DDP处理24 h后，L／S比值与转染前比较差异无统计学意义（t＝0.632，P＝0.562），其余各质量浓度DDP处理A549和A549／DDP细胞24 h后的FANCD2蛋白总量及L／S比值均较对照组明显降低（P均＜0.05，图2C），表明FANCD2单泛素化水平降低。

图2 FANCD2-siRNA转染前后肺癌细胞株经DDP处理后的FANCD2单泛素化水平（L／S）

2.3 FANCD2-siRNA转染前后肺癌细胞FANCD2核聚小体的表达

免疫荧光检测结果显示，A549细胞经5μg／mL DDP处理24 h和48 h后，及FANCD2-siRNA转染后再经5μg／mL DDP处理24 h，胞核内核聚小体表达无明显改变。A549／DDP细胞经5μg／mLDDP处理24 h和48 h后，胞核内FANCD2核聚小体表达增强（核聚小体形成）；FANCD2-siRNA转染后，经5 μg／mL DDP处理24 h，胞核内FANCD2核聚小体表达明显降低。见图3。

图3 各组细胞胞核内FANCD2核聚小体的表达

3 讨论

DDP作为肺癌治疗方案中的一线化疗药物，属于广谱细胞周期非特异性抗癌药物，可入核共价结合于DNA复制叉位置，形成链间交联（85%～90%）和链内交联（1%～2%）以及单加合物［6，10］，阻滞DNA复制及转录，其中以链内交联的阻滞作用最强。研究表明，多种经典DNA修复，包括NER、BER、HRR、NHEJ等均不同程度地参与铂类药物所致DNA损伤的修复［8，11－13］。链内交联的修复几乎完全依赖FANCD2蛋白的单泛素化能力［14］，具有完整FA／BRCA途径功能的肿瘤细胞经DDP处理后，在S期被激活，表现为FA／BRCA途径上游的各种蛋白高表达，继而FANCD2单泛素化水平升高，DNA修复能力增强，此即为肿瘤细胞对DDP耐药的重要分子生物学基础。

FA／BRCA途径被激活时，上游的8个基因（FANC-A，B，C，E，F，G，L，M）编码的蛋白与多个FA／BRCA途径相关蛋白组成FA核心复合体，然后在泛素化结合酶（E2）作用下单泛素化FANCD2和FANCI，形成ID复合体，并与下游蛋白FANCJ、FANCN、BRCA1、BRCA2以及RAD51，ATR等相互作用，共定位于DNA损伤部位形成核聚小体，进而作用于FA／BRCA途径下游基因，使NER、HRR等途径被激活，启动并共同参与DDP等交联剂类化疗药物所致DNA损伤的修复［8，11－13］。多项研究表明，FA／BRCA途径基因存在突变、缺失、甲基化修饰等的肿瘤细胞株对DDP等交联剂类化疗药物有较高敏感性，应用基因导入、去甲基化等技术处理恢复相关基因功能后，细胞株FANCD2单泛素化水平升高或恢复，对DDP敏感性下降，表现为经DDP处理后细胞存活率升高、凋亡下降、细胞S／G2周期阻滞效应减弱等［6，15－18］，进一步证实了FA／BRCA途径在肿瘤细胞DDP耐药机制中的重要作用。这也从另一方面提示，通过沉默FA／BRCA途径某些基因的表达而抑制FA／BRCA途径功能后，可以增加肿瘤细胞对DDP的敏感性。

正常细胞的FA／BRCA途径基因缺损可能导致基因组不稳定，DNA修复功能缺损，基因突变多发及增加肿瘤的易感性。而肿瘤细胞FA／BRCA途径抑制则可增加肿瘤对交联剂类化疗药物的敏感性，提高化疗效果，为肿瘤的个体化治疗提供新方案［19］。

本实验结果显示，A549／DDP细胞对DDP的敏感性明显低于A549细胞，但FANCD2蛋白表达水平和FANCD2单泛素化水平，以及FANCD2核聚小体形成均明显高于A549细胞，提示A549／DDP细胞对DDP敏感性下降的原因一定程度上是FA／BRCA途径修复DNA损伤的功能强于A549细胞。应用siRNA技术沉默A549和A549／DDP细胞的FA／BRCA途径关键基因FANCD2后，这两种肺癌细胞株的IC50均显著降低，FANCD2蛋白表达及单泛素化水平均降低，对DDP敏感性均显著提高，表明FA／BRCA途径参与A549／DDP细胞株对DDP耐药，应用siRNA技术抑制FA／BRCA途径FANCD2基因至少可部分逆转其对DDP的耐药性。

综上所述，FA／BRCA途径激活和高表达是肺癌细胞对DDP耐药的重要分子生物学基础，抑制此途径FANCD2基因表达，可以部分逆转肺癌细胞对DDP的耐药性。这些研究结果将可能为今后在临床上通过检测肿瘤细胞的FA／BRCA途径基因表达，或应用分子生物学技术抑制FA／BRCA途径功能，为化疗肺癌患者制定个体化治疗方案提供一定依据。

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Silence of FANCD2 gene of FA／BRCA pathway reverse the resistance to cisplatin in lung cancer A549／DDP cell line

JIANG He-guo1，DAIChun-hua1，LIJian1，CHEN Yong-chang2，LAN Ting2，WU Min2
（1.Department of Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of Basal Medicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effect of FANCD2 gene silence on the resistance to cisplatin（DDP）in lung adenocarcinoma A549／DDP cell line.M ethods：FANCD2 genes of A549／DDP cells were silenced by transfection of the designed and synthesized siRNA targeted FANCD2（FANCD2-siRNA）through Lipofectamine.CCK-8 techniquewas used tomeasure the cell proliferation rate of A549 and A549／DDP cells treated with DDP before and after siRNA transfection.Western blotting was carried out to detect the expression ofmonoubiquitination（L）and non-monoubiquitination（S）FANCD2 protein and L／S ratio before and after siRNA transfection.Immunofluorescence assay was performed to determine the formation of FANCD2 nuclear foci.Results：The cell proliferation rate and the levels of FANCD2 monoubiquitination（L／S ratio）weremarkedly higher in A549／DDP cells than in A549 cells treated with DDP（P＜0.05）.After transfection of FANCD2-siRNA，the levels of FANCD2 monoubiquitination，nuclear foci formation of FANCD2，and the cell proliferation ratewere significantly decreased in A549 and A549／DDP cells following DDP treatment（P＜0.05）.Conclusion：Silence of FANCD2 gene inhibited the function of FA／BRCA pathway by decreasing the monoubiquitination level and nuclear focus formation of FANCD2，resulting in the decrease of cell proliferation，and partial reversion of chemoresistance to cisplatin in lung cancer cell of DDP-resistance.

lung cancer cell；cisplatin；chemoresistance；FA／BRCA pathway；FANCD2；siRNA

姜贺果（1987—），男，硕士研究生；李坚（通讯作者），教授，主任医师，博士生导师，E-mail：lijian541226＠163.com

R392.28；R979.1

A

1671－7783（2014）03－0201－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y140009

2014－01－07 ［编辑］刘星星