低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

李兴天，李小战，马红，许辉，李淑，李遇梅

（江苏大学附属医院皮肤科，江苏镇江212001）

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

李兴天，李小战，马红，许辉，李淑，李遇梅

（江苏大学附属医院皮肤科，江苏镇江212001）

目的：比较人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs）冻存前和复苏后的生物学特性，为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法：采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs，体外培养扩增，将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月，复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率，采用MTT法绘制细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞表面抗原，成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力，RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2（peroxisome proliferator-activated receptorγ-2，PPARγ-2）和成骨特异性基因骨钙素（osteocalcin，OC）的表达情况。结果：随冻存时间的延长细胞存活率略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能，且RT-PCR结果显示，PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率，生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。

人脂肪间充质干细胞；冻存；生物学特性；干细胞库

脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的间充质干细胞，由于取材方便、对机体损伤小且易于体外培养，已在再生医学研究中受到广泛关注。近期有研究显示，hADSCs免疫原性低，不表达HLAⅡ类抗原且能调节T淋巴细胞的活性［1］，可以用于移植物抗宿主反应或自身免疫性疾病的治疗。将ADSCs低温保存，就可以在患者需要的时候进行同种同体或同种异体细胞移植，挽救患者生命。本研究将第3代ADSCs置于液氮中分别保存1、3和6个月，初步探讨低温冻存对人ADSCs生物学特性的影响，为今后建立低温干细胞库提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 标本采集

脂肪组织取自2013年在江苏大学附属医院产科接受手术的7例产妇腹部大网膜，产妇年龄17～33岁，平均26岁。患者对实验知情同意，且实验经医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

低糖-DMEM、高糖-DMEM（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅰ型胶原酶（Gibco公司），噻唑蓝、胰蛋白酶（Amresco公司），鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照（eBioscience公司），地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素（Sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），反转录试剂盒、SYBR-PCR试剂盒（TaKaRa公司），酶联免疫检测仪（Clinibio公司），流式细胞仪（BD公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 hADSCs的分离和培养 外科无菌条件下取出脂肪组织约10 mL，PBS吹打清洗3次，尽量去除脂肪表面的结缔组织和血管，剪成1 mm×1 mm× 1 mm的组织块，加入2倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化45 min，期间每5 min取出剧烈震荡，加入含10%胎牛血清低糖-DMEM终止消化，1 500 r／min离心10 min，去除上层漂浮的脂肪组织，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。加入完全培养液（含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／mL链霉素的低糖DMEM）重悬、接种，置于37℃，5% CO2培养箱中培养，24 h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，以0.25%胰酶0.02%EDTA消化传代。

1.3.2 hADSCs的冻存和复苏 当处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs生长至80%融合时，用0.25%胰酶 0.02%EDTA消化液消化，离心弃上清，加入冻存液（含10%DMSO、90%胎牛血清），调整细胞终密度为1×106／mL，分装于冻存管中。经4℃30 min→－20℃2 h→－70℃过夜→液氮。分别于冻存1个月、3个月和6个月后取出冻存管，置于37℃恒温水浴箱内，并不断摇动以促进融化。将细胞悬液转至离心管中，加入10倍体积的完全培养液离心弃上清，再重悬于完全培养液，待细胞达到80%融合时，常规消化传代。

1.3.3 细胞存活率检测 复苏后，取出部分细胞悬液按1∶1与0.4%台盼蓝溶液混匀1min，采用血细胞计数板计数法，光镜下计数被染成蓝色的死细胞数和未染的活细胞数。细胞存活率（%）＝（活细胞数／细胞总数）×100%。

1.3.4 MTT法绘制细胞生长曲线 取冻存前及复苏后的第5代hADSCs，用培养液制成2×104／mL细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μL。自第2天起，每天固定时间取1块96孔板，于各孔内加入5 mg／mLMTT 20μL，置于37℃恒温培养箱中孵育4 h后吸去上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，摇床振荡10 min。酶联免疫检测仪上490 nm波长处读出光密度（D）值。连测8 d，以光密度值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。

1.3.5 细胞免疫表型检测 消化收集冻存前及复苏后的第5代hADSCs，1 000 r／min离心5 min，用PBS重悬分装于1.5 mL的EP管中，每管100μL，细胞密度为105／mL，加入鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其同型对照IgG2a-FITC、IgG1-PE。4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，加PBS 300μL重悬后采用流式细胞仪检测细胞表面抗原。

1.3.6 成脂成骨分化鉴定 取冻存前及复苏后的第5代hADSCs接种于6孔板中，待达到80%融合时，分别改用成脂诱导培养液（含10%胎牛血清、0.5 mmol／L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μmol／L地塞米松、10μmol／L胰岛素、200μmol／L吲哚美辛的高糖DMEM）和成骨诱导培养液（含10%胎牛血清、0.1μmol／L地塞米松、50μmol／L抗坏血酸磷酸盐、10 mmol／Lβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM）诱导2周，每周换液2次，对照组加完全培养液。2周后分别用油红O［2］和von Kossa染色［3］鉴定脂滴和钙结节。1.3.7 RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2（PPARγ-2）和成骨特异性基因骨钙素的表达 取冻存前及复苏后的第5代hADSCs接种于6孔板中，待达到80%融合时，分别改用成脂诱导培养液和成骨诱导培养液诱导1周，换液2次，对照组加完全培养液。使用Trizol法提取对照组、成脂组及成骨组的RNA作为模板进行反转录，最后按照RT-PCR试剂盒说明书对PPARγ-2及骨钙素进行扩增，以β-肌动蛋白为内参，结果用2－ΔΔCt法换算。扩增基因引物序列见表1。

表1 扩增基因引物序列

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 hADSCs分离培养

hADSCs原代培养48 h后，可见散在贴壁细胞，于第7至第8天细胞融合至80%～90%传代，当传至第3代，细胞生长形态均一，呈放射状、河流状的梭形细胞（图1）。

2.2 hADSCs冻存复苏后的存活率

图1 脂肪间充质干细胞形态（100×）

采用台盼蓝染色方法计数，第3代hADSCs经冻存1个月、3个月和6个月后，平均存活率分别为（95.39±3.09）%，（89.58±5.25）%和（85.39± 4.15）%，存活率随冻存时间的延长略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 细胞生长曲线

生长曲线显示第5代hADSCs冻存前及冻存1个月、3个月和6个月的增殖情况无明显差异，均呈“S”形，在接种第3天进入对数生长期，第7天进入平台期（图2）。

图2 冻存复苏前后人脂肪间充质干细胞生长曲线

2.4 细胞免疫表型

冻存前及冻存1个月、3个月和6个月第5代hADSCs均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表达CD45和HLA-DR（图3和表2），各时间段间表达率的差异无统计学意义。

表2 冻存复苏前后人脂肪间充质干细胞表面抗原分布情况 %

图3 冻存复苏前后人脂肪间充质干细胞表面抗原表达

2.5 成脂成骨分化鉴定

冻存前和复苏后hADSCs经2周成脂成骨诱导，油红O染色可见成脂细胞内有较多鲜红色脂滴，部分小脂滴融合成较大的脂滴，von Kossa染色可见黑褐色矿化钙结节聚集（图4），而对照组均为阴性。

图4 冻存前和复苏后hADSCs成脂成骨分化鉴定（×200）

2.6 PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达

冻存前及冻存1个月、3个月和6个月第5代hADSCs经成脂和成骨诱导1周后，PPARγ-2 mRNA的相对表达量分别为5.55±0.48，5.45±0.40，5.15±0.18和5.58±0.37，各时间点间的差异无统计学意义（F＝0.84，P＞0.05）；骨钙素mRNA的相对表达量分别为1.27±0.13，1.38±0.11，1.25± 0.12和1.32±0.16，各时间点间的差异亦无统计学意义（F＝0.57，P＞0.05）。结果表明冻存与否以及冻存时间对两种基因的表达量无明显影响。

3 讨论

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。Gimble等［4］提出干细胞在再生医学上运用需满足以下几点：① 来源丰富；② 对机体损伤小；③具有多向分化潜能；④ 可安全有效地进行自体或同种异体移植；⑤ 可在良好作业规范指导下操作。脂肪组织完全满足再生医学的这些要求，如1 g脂肪组织可以产生接近5 000个干细胞，是1 g骨髓中间充质干细胞的500倍［5］。因此，ADSCs正成为比骨髓间充质干细胞更理想的干细胞来源。

最近有研究显示，冻存1年的人脐带血管内皮细胞生物学特性无明显改变［6］。将抽脂术所得脂肪长期冻存于液氮，复苏后提取的ADSCs细胞数量仍可达到新鲜组织的90%［7］。如将特定代数的ADSCs进行低温液氮冷冻保存，在需要时复苏，就可以由少量细胞传代扩增获得足够的干细胞，为免疫性疾病和再生医学治疗提供良好的种子细胞。

细胞低温冻存最大的挑战是冷冻和融化复苏对细胞膜的致死性破坏［8］。本研究中，我们使用二甲基亚砜（DMSO）保护细胞，在低温环境下可以阻止细胞内冰晶的形成。采用缓慢的冻存过程（4℃30 min→－20℃2 h→－70℃过夜→液氮），复苏时，37℃恒温水浴箱内不断摇动令其尽快融化，这一慢冻快融的方法可以尽量减少冰晶的形成从而避免细胞膜被破坏，提高了细胞存活率。实验中，我们将冻存的细胞复苏后，台盼蓝染色发现冻存6个月细胞存活率仍保持在80%以上且保持较高的增殖能力，证实慢冻快融是一种切实可行的冻存方法。

冻存前后一个重要的观察指标是hADSCs表面分子标志，本实验冻存复苏后hADSCs均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表达CD45和HLA-DR，免疫表型符合MSCs的鉴定标准［9－10］。此外，在成脂成骨诱导条件下，冻存复苏后hADSCs仍可表达脂肪细胞特异性基因PPARγ-2［11］和成骨细胞特异性基因骨钙素［12］，且油红和von Kossa染色也证实其多向分化能力保持不变。

值得思考的是，DMSO在常温下具有毒性，因此复苏的细胞需经洗涤和离心以尽可能除去或减少培养基中DMSO的浓度，能否找到一种无毒有效的冻存剂来替代DMSO，有待进一步的实验探索。

本实验不能确定冻存超过6个月后干细胞特性有无明显变化，但单次液氮－196℃储存6个月后，hADSCs具有高存活率，生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能，为今后建立低温干细胞库提供了实验支持。

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Effect of cryopreservation on biological characteristics of human adipose-derived mesenchymal stem cells

LIXing-tian，LIXiao-zhan，MAHong，XU Hui，LIShu，LIYu-mei
（Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To provide the experimental support for establishing a low-temperature stem cell bank for future use，freeze-thawed human adipose-derived mesenchymal stem cells（hADSCs）were compared with fresh hADSCs in vitro.M ethods：The hADSCs were isolated from abdomen epiploica adipose tissue by collagenase digestion and subcultured in vitro.The third passage of hADSCswas cryopreserved in liquid nitrogen for 1，3，and 6 months.Cell viability，proliferation potential，expression of cellularmarkers and multipotential differentiation were studied after thawing using trypan blue staining，MTTmethod，flow cytometry analysis，Oil Red O staining，von Kossa，and RT-PCR.Results：After thawing，cell survival rate was found to descend as the time of cryopreservation prolonged.MTT revealed high capability for the proliferation.Phenotypic studies revealed that hADSCswere positive for CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD166 and negative for CD45，and HLA-DR.Functional analysis demonstrated these cells could be differentiated into adipocytes and osteoblasts in lineage-specific medium.RT-PCR results proved that adipogenic and osteogenic related genes could be expressed.No significant difference（P＞0.05）was noted before and after the cryopreservation in cell viability，proliferation potential，expression of cellularmarkers and multipotential differentiation.Conclusions：The hADSCs could maintain acceptable viability，biological characteristics，and multipotential differentiation after cryopreservation.

human adipose-derived mesenchymal stem cells；cryopreservation；biological characteristics；stem cell bank

李兴天（1987—），男，硕士研究生；李遇梅（通讯作者），副教授，硕士生导师，E-mail：drlymmg＠gmail.com

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0190－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140070

国家自然科学基金资助项目（30972663）

2014－03－22 ［编辑］ 陈海林