NGF和VEGF在早期复发性流产患者中的意义

王婷婷，郑梅玲，王治鸿，贺江梅，张桂林，化爱玲

(山西医科大学第一医院计划生育研究室，太原 030001)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指与同一性伴侣连续发生2次或2次以上的自然流产，除外已知原因，目前仍有50%的复发性流产原因不明，是临床预防和治疗的难点。近年来，研究发现，神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、血管内皮生长因子(endothelial factor,VEGF)有促进血管生成的作用，本研究通过探讨两个因子对母胎界面血管生成的作用，以了解复发性流产的可能发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选自2012年7月至2013年7月间来我院妇产科门诊就诊的复发性流产患者25例作为病例组，既往均有2次或2次以上自然流产史，除外夫妇双方染色体异常，生殖器解剖畸形，免疫因素，病毒感染，内分泌异常，男方精液异常等因素。选自同一时期来我院行人工流产自愿终止妊娠的正常健康早孕妇女25例作为对照组，既往有正常分娩史，无自然流产史，B型超声检查提示胚胎有胚芽及原始心管搏动。两组妊娠妇女年龄20～34岁，孕周6～12周，年龄及孕周的比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 外周血中NGF、VEGF浓度的测定 采集两组妊娠妇女空腹外周静脉血2 ml，离心后取血清，将血清置于-20℃冰箱保存，使用时统一解冻，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定NGF、VEGF在血清中的浓度(单位：pg/ml)，操作步骤按试剂盒(购自武汉博士德生物技术公司)说明书进行,用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值(OD),通过绘制标准曲线求出血清中NGF、VEGF的浓度。

1.3 绒毛、蜕膜组织中NGF、VEGF蛋白表达量的检测 收集两组妊娠妇女人工流产后新鲜的绒毛及蜕膜组织，生理盐水反复冲洗，去掉血液后，10%甲醛固定24 h，石蜡包埋甲醛固定后的绒毛、蜕膜组织，连续切片，厚1.5 μm,应用免疫组织化学法检测绒毛及蜕膜组织中NGF、VEGF的蛋白表达量，操作步骤按试剂盒(购自武汉博士德生物技术公司)说明书进行。 结果判读：光学显微镜下观察细胞浆内有淡黄、黄色、棕黄色颗粒沉着为阳性表达，每张切片(放大400×)随机选择5个不重叠的视野，测定每个视野的阳性表达的平均灰光度值(注：平均灰光度值与蛋白表达量呈反比)。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，所测数据以χ2表示，组间比较采用方差分析和t检验，相关资料采用Pearson相关分析，P<0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 绒毛、蜕膜组织中NGF、VEGF的表达 免疫组化染色结果表明，在病例组、对照组的绒毛、蜕膜细胞浆内NGF、VEGF阳性颗粒，结果见图1。

2.2 外周血中NGF、VEGF蛋白的浓度 病例组绒毛、蜕膜组织中的NGF、VEGF蛋白表达量及在外周血中的浓度均低于对照组，两组间比较，差异有统计学意义(P均<0.05)，结果见表1，表2。

2.3 NGF、VEGF在两组妊娠妇女绒毛、蜕膜组织及血清中的相关性分析 NGF、VEGF在病例组、对照组血清中的水平呈正相关(r1=0.965, r2=0.733,P均<0.05), 绒毛及蜕膜组织中的表达不存在相关性(r3=0.378, r4=-0.049, r5=0.542, r6=-0.175 ,P均>0.05)。

图1 绒毛、绒毛中NGF和VEGF的表达

A: 流产组绒毛中NGF的表达,×250; B: 对照组绒毛中NGF的表达,×250; C: 流产组蜕膜中NGF的表达,×100; D: 对照组蜕膜中NGF的表达,×100; E: 流产组绒毛中VEGF的表达,×250; F: 对照组绒毛中VEGF的表达,×250; G: 流产组蜕膜中VEGF的表达,×100; H: 对照组蜕膜中VEGF的表达,×100

表1 NGF、VEGF在两组妊娠妇女绒毛、蜕膜组织中的平均灰光度值(OD)比较

表2 NGF在两组妊娠妇女血清中的浓度比较 (pg/ml)

3 讨 论

胎盘是胎儿与母体进行物质交换的器官，所以胎盘良好的生长与发育是成功妊娠的关键。在胎盘形成和植入的过程中，有丰富的血管生成。研究表明，许多不明原因复发性流产的发生与胎盘组织中血管增生不平衡和胎儿血液供应不足有密切关系。

神经生长因子是神经营养因子家族中的一员，主要功能是促进神经细胞的生成和增殖，参与中枢及周围神经的生长发育，但近年来研究发现，NGF可通过VEGF的表达而间接地促进血管生成，甚至认为NGF具有直接促进血管生成的作用，而将NGF称为血管诱导因子，并认为其促进血管生成的作用优于促进神经再生的作用[1]。近年来，有文献报道，NGF在大鼠角膜、小鸡胚胎尿囊绒膜、缺血的小鼠内收肌、肝癌、食管癌等非神经器官和组织中具有血管生成作用。张果果等[2]通过免疫组化实验证实，NGF有促进胚胎血管生成的作用，其在绒毛组织中表达降低，导致了流产的发生。本研究结果显示，NGF在RSA患者绒毛、蜕膜组织中的表达及在血清中的水平显著低于正常早孕者，提示NGF表达降低可能是导致RSA的原因。

血管内皮生长因子属血小板源性生长因子家族的一员， Zammiti等[3]研究发现，敲除小鼠受精卵VEGF的基因，小鼠胚胎血管完全缺如，最终导致胚胎死亡，可见在早期妊娠胚胎血管生成中，VEGF起关键作用。Rabban等[4]研究显示：在受精卵植入期，VEGF在促进子宫内膜血管的增生和维持血管的通透性方面起关键作用，在妊娠早期胎儿胎盘的生长和发育过程中，VEGF促进了胎盘部位的血管形成及分化，抑制VEGF的功能，导致胚胎着床失败甚至胚胎死亡。本研究结果显示，VEGF在RSA患者绒毛、蜕膜组织中的表达及在血清中的水平显著低于正常早孕者，提示VEGF表达降低可能是导致RSA的原因。

张玉波等[5]用Wistar大鼠进行免疫组化实验发现，不同剂量的NGF均能显著促进再生坐骨神经内VEGF的表达和再生坐骨神经内血管生成，并随着NGF给药量的增加，VEGF的表达也随之显著增加，说明在促进再生坐骨神经内血管生成方面，NGF与VEGF呈正相关。Middeke等[6]对嗜铬细胞瘤细胞系P12的研究和Calza等[7]对新生大鼠颈上神经节的研究均证实，NGF、VEGF有促进血管生成的作用，且NGF与VEGF呈正相关。本研究结果显示，NGF、VEGF在复发性流产组、正常妊娠组血清中的水平呈正相关，但在绒毛及蜕膜组织中的表达不存在相关性，可能与本实验研究的样本量小有关。

综上所述，NGF、VEGF有促进胎盘血管形成的作用，NGF、VEGF表达降低可能是导致RSA的原因，但NGF、VEGF促进血管生成机制尚未完全阐明，有待进一步研究。

参考文献

[1]Dechant G，Barde Y A.The neurotrophin receptor p75(NTR)：novel functions and implications for diseases of the nervous system[J].NatureNeurosei,2002,5(11):1131-1136.

[2]张果果,陈 虹.NGF与其受体P75在自然流产绒毛组织中表达的研究[J].中国妇幼保健杂志,2011,26(12):1831-1833.

[3]Zammiti W,Mtiraoui N,Kallel C,etal. A case-control study on the association of idiopathic recurrent pregnancy loss with autoantibodies anaginst beta-glycoportein I and annexin V[J].Reproduction,2006,131(4):817-822.

[4]Rabbani M L,Rogers P A.Role of vascular endothelial growth factor in endometrial vascular events before inplantation in rats[J].Reproduction,2001,122(1)：85-90.

[5]张玉波,伍亚民,杨恒文,等.NGF促再生周围神经血管生成的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2005,13(18):1410-1412.

[6] Middede M,Hoffmann S,Hassan I,etal.In vitro and in vivo angigenesis in PC12 pheochromocytoma cells in mediated by vascular endothelial growth factor[J].ExpClinEndocrinolDiabetes,2002,110(8):386-392.

[7] Calza C L,Giardino L,Giuliani A,etal.Nerve growth factor control of neuronal expression of angiogenetic and vasoactive factors[J].ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(7):4160-4165.