复方桑椹三七对链脲霉素糖尿病小鼠血糖与胰岛病理的影响

杜正彩 邓家刚 黄庆 庞国凤 李好文

复方桑椹三七对链脲霉素糖尿病小鼠血糖与胰岛病理的影响

杜正彩 邓家刚 黄庆 庞国凤 李好文

目的 研究复方桑椹三七（CMN）对链脲霉素致糖尿病小鼠血糖与胰岛病理的影响。方法 取雄性昆明（KM）小鼠，用链脲霉素(STZ)（150 mg/kg）腹腔注射造模，选取血糖值在11～25 mmol/L小鼠50只，随机分为模型组，阳性组（格列苯脲5 mg/kg），CMN高、中、低（9．0，3．0，1．5 g/kg）剂量组（n=10），另取10只未造模小鼠为正常对照组。灌胃给药30 d，测定小鼠饮食、体质量、血糖、血清胰岛素水平，并将小鼠胰岛β细胞免疫染色，观察其病理变化。结果 CMN对糖尿病小鼠摄食量、排尿量、饮水量、空腹血糖与胰岛素水平的影响与模型组比较差异有统计学意义（P＜0．01或P＜0．05）；病理切片显示CMN可使小鼠胰岛β细胞免疫染色阳性数量明显增加，病理损伤明显好转，具体数据为，摄食量：正常组为（5．13±0．67）、模型组为（8．91±0．81）、格列苯脲组为（6．6±0．83）、CMN高剂量组为（4．56±0．89）、CMN中剂量组为（6．63±0．49）、CMN低剂量组为（8．26±0．92）；饮水量：正常组为（6．21±0．59）、模型组为（21．95±5．58）、格列苯脲组为（13．13±1．73）、CMN高剂量组为（10．19±2．00）、CMN中剂量组为（13．45±2．82）、CMN低剂量组为（16．80±5．68）；排尿量：正常组为（4．17±0．49）、模型组为（20．31±4．97）、格列苯脲组为（11．38±1．98）、CMN高剂量组为（9．63±2．13）、CMN中剂量组为（12．49±2．79）、CMN低剂量组为（15．53±5．66）；空腹血糖（第30天）：正常组为（4．91±0．89）、模型组为（20．58±6．69）、格列苯脲组为（12．71±6．60）、CMN高剂量组为（11．73±3．55）、CMN中剂量组为（12．52±6．78）、CMN低剂量组为（14．28±5．57）；血清胰岛素水平：正常组为（10．12±1．27）、模型组为（4．68±1．29）、格列苯脲组为（6．80±1．54）、CMN为高剂量组（6．23±1．62）、CMN中剂量组为（5．93±1．12）、CMN低剂量组为（5．72±0．97）；胰岛病理评分：正常组为（2．90±0．54）、模型组为（1．00±0．82）、格列苯脲组为（2．00±0．77）、CMN高剂量组为（2．40±0．49）、CMN中剂量组为（2．10±0．83）、CMN低剂量组为（1．90±0．54）。结论 CMN对糖尿病小鼠摄食量、饮水量、排尿量及空腹血糖具有明显降低作用，这可能与其保护修复胰岛β细胞，恢复胰岛素的分泌水平相关。

桑椹；三七；小鼠；链脲霉素；糖尿病

桑椹为桑科桑Morus alba L.的果穗，唐·苏敬《新修本草》记载“单食，止消渴”，中国药典记载主治“津伤口渴，内热消渴”，现代研究其具有降血糖的作用[1-3]。三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，具有活血、止血、定痛的作用，现代研究表明它具有降血糖，降血脂，改善糖尿病微血管病变等作用[4-6]。复方桑椹三七（Compound Mulberry fruit notoginseng，CMN）是广西中医药大学邓家刚教授治疗糖尿病临床验方，在临床实践中将桑椹三七配伍应用，发现其具有明显解除糖尿病患者口渴多饮的作用，并能减少糖尿病患者微血管病变等并发症。本研究采用链脲霉素(STZ)致糖尿病小鼠来研究复方桑椹三七的降血糖作用及其作用机制，为今后产品开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物 桑椹（熟），产地广西，南宁生源中药饮片有限责任公司，批号：20101001；三七（30头），产地广西，南宁生源中药饮片有限责任公司，批号：20100902（药材经广西中医药大学韦松基教授鉴定为正品）。

取桑椹500 g、三七500 g混合，加10倍量水，浸泡1 h后，煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并药液，浓缩至1000 mL，冷却至室温，然后缓慢加入2000 mL的95%乙醇，边加边用玻璃棒缓慢搅拌，沉淀过夜，过滤，滤液浓缩至500 mL（2 g/mL）每毫升相当2.0 g原生药（备用）。

1.2 动物 SPF级雄性昆明（KM）小鼠，体质量（20±2）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，质量合格证号No.20101805，许可证号：SCXK（湘）2009-0004。实验动物室温度：22～25℃，相对湿度：55%～70%。

1.3 试剂 STZ，25 g/瓶，美国Sigma-Aldrich，Lot# BCBB 7829；格列本脲片，2.5 mg/片，天津太平洋制药有限公司，批号：101003；血糖测试条，长沙三诺生物传感技术有限公司，批号：20100505；小鼠胰岛素（INS）定量检测ELISA试剂盒，美国R&D公司，批号：20101103；Mouse Anti-Insulin、DBA显色试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，批号；20101103。

1.4 仪器 Thermo scientifi 1500-multiskan spectrum酶标仪，美国；Thermo-22190石蜡病理切片机，美国。低温超速离心机（TGL-16 M），湖南塞特湘仪有限公司；EL 204十万分之一克电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；安稳血糖快速测试仪，长沙三诺生物传感技术有限公司。

1.5 方法[7]取雄性KM小鼠80只，适应性饲养1周后体质量（25±2）g，按体质量随机分出10只为正常对照组，其余70只用于造模。所有小鼠禁食（每次禁食的同时必须换垫料，下同）不禁水12 h，除正常对照组注射等体积生理盐水外，其余各鼠腹腔注射链脲霉素，小鼠剂量150 mg/kg（临用前溶解于0.1 mol/ L、pH 4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，现配现用，置于冰上）。造模5 d后，禁食不禁水3 h，尾静脉取血，用快速血糖仪测试血糖。除正常组外，其余小鼠取血糖值在11～25 mmol/L的糖尿病小鼠50只，按血糖高低重新随机分为模型组，阳性组（格列苯脲5 mg/kg），CMN高、中、低（9.0，3.0，1.5g/kg）剂量组，每组10只，灌胃给药，1次/d，正常组、模型组给蒸馏水，疗程为30 d，于给药第0与第30 d测空腹血糖值（禁食同前），比较各组动物血糖值及血糖下降百分率，血糖下降百分率=（实验前血糖值-实验后血糖值）/实验前血糖值×100%。每天测定小鼠饮水量、摄食量与体质量；换垫料1次/d，排尿量=（末时垫料湿重-初始垫料干重）×80%。末次给药后，禁食不禁水3 h，尾静脉取血，用快速血糖仪测试血糖，摘眼球取血测定血清胰岛素水平（按试剂盒说明进行）。

胰岛β细胞免疫染色：眼球取血后，随即颈椎脱臼处死小鼠，同时迅速在解剖镜下解剖胰腺组织，用福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，制成4 μm石蜡切片，染色，按S-P试剂盒说明进行操作，DBA染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。β细胞阳性表达根据呈显不同程度的棕黄色团块数及其面积大小，可分为5个等级评分：在1张切片内，若棕黄色团块数（β细胞阳性表达）≤3个，且团块面积均很小时，计为0分；若棕黄色团块数在4～6个，且面积较大时，计为1分；若棕黄色团块数在7～9个，且面积较大时，计为2分；若棕黄色团块数在10～12个，且面积较大时，计为3分；若棕黄色团块数≥13个，且面积较大时，计为4分。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件处理数据。正态计量资料以“x±s”表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 CMN对糖尿病小鼠饮水量、排尿量与摄食量的影响如表1所示，与模型组比较，CMN高、中、低剂量组小鼠的摄食量、饮水量、排尿量明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 CMN对糖尿病小鼠摄食量、饮水量与排尿量影响试验结果

2.2 CMN对糖尿病小鼠体质量的影响 如表2所示，小鼠的初始体质量在CMN各剂量组、阳性组与模型组间比较，差异均无统计学意义。即小鼠的初始体质量在各组间较为均衡。第14 d、30 d，各实验组与模型组小鼠体质量相比较，差异无统计学意义。实验各组小鼠体质量与正常组小鼠比较，差异无统计学意义。

表2 CMN对糖尿病小鼠体质量影响试验结果

2.3 CMN对糖尿病小鼠空腹血糖的影响 如表3所示，试验前，各试验组均与模型组比较，正常组小鼠空腹血糖值明显低于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，其他各组差异无统计学意义。说明造模成功，且各试验组间血糖值均一；试验后，各试验组与模型组比较，CMN高、中、低剂量组小鼠空腹血糖值明显低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）；试验前后各试验组血糖下降百分率与模型组比较，CMN各剂量组血糖下降百分率明显大于模型组（P＜0.01或P＜0.05）。

表3 CMN对糖尿病小鼠空腹血糖影响试验结果

2.4 CMN对糖尿病小鼠血清胰岛素水平及胰岛病理学的影响 如表4所示，与模型组比较，正常组小鼠胰岛β细胞阳性染色病理积分与INS水平明显高于模型组（P＜0.01）；除CMN低剂量组血清INS水平外，CMN各剂量组可使糖尿病小鼠胰岛β细胞阳性染色病理积分与血清INS水平明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 CMN对糖尿病小鼠血清胰岛素水平及胰岛病理学的影响

如图1 A所示，正常组胰岛细胞免疫组化染色均匀，境界清晰，胰岛细胞椭圆型，胞浆丰富，核圆居中，胰岛面积大，胰岛细胞数量多、岛内细胞均匀分布；如图1 B所示，糖尿病模型组胰岛细胞免疫组化染色不均匀，胰岛面积、胰岛细胞数量明显减少，岛内细胞尤其是中心部细胞明显空泡化、减少，甚至消失；如图1 C-F所示，各药物组胰岛细胞免疫组化染色比较均匀，胰岛数量、面积有改善，胰岛细胞边界尚清晰，细胞排列尚规则、整齐，细胞致密度略增加。

3 讨论

糖尿病是一种非传染性慢性内分泌代谢性疾病，多伴有并发症。随着社会经济的发展、人们饮食结构的变化，糖尿病患病率逐年增高。在2011年11月14日国际糖尿病日，国际糖尿病联合会(IDF)的权威指南《Diabetes Atlas》新发布的数据表明，当前全世界成年糖尿病人数已达3.66亿人，到2030年，糖尿病患者将增至5.52亿人。而我国20岁以上成人中，糖尿病患病率达到9.7%，我国以9240万的患者人数成为世界糖尿病“第一大国”[8]。

糖尿病容易并发全身神经、微血管、大血管病变，并可导致心、脑、肾、神经及眼等组织器官的慢性进行性病变，诸多并发症日趋增多，程度加重，严重危害着患者健康和生命。对糖尿病的治疗以饮食疗法、运动疗法和药物疗法为主。目前国内外常用的降糖西药有磺酰脲类，双胍类，α-葡萄糖苷酶抑制剂及胰岛素等，这些药物疗效确切，但不良反应也往往比较严重。

图1 CMN对糖尿病小鼠胰岛病理学影响

中医药对糖尿病防治具有悠久的历史，积累了丰富的经验，并形成独特理论认识。许多有效方药可明显改善糖尿病患者的“三多一少”症状，并可有效减少糖尿病的并发症。糖尿病属于中医“消渴”范畴，其病机主要为气阴两虚，燥热偏盛，癖血阻滞等。广西中医药大学邓家刚教授，在临床实践中发现糖尿病患者均表现不同程度的阴虚燥热口渴与血脉瘀滞的症状，他主张治疗糖尿病当以“滋阴活血”为主，用药以桑椹三七为主药，随症加减，在长期的临床实践中形成了“复方桑椹三七”，方中君药桑椹滋阴补肾，解除糖尿病患者口渴多饮多尿，臣药三七益气活血化瘀，改善患者微血管病变等各种并发症，二药合用滋阴活血兼顾，随症加减，临床疗效尚可。

本研究结果表明，CMN对STZ致糖尿病小鼠摄食量、饮水量、排尿量及空腹血糖具有明显降低作用，这可能与其保护胰岛β细胞，恢复胰岛素的分泌水平相关。本研究为CMN后期产品开发提供了研究基础。

[1] 王瑞坡．桑椹黄酮的制备及其降血糖和降尿酸作用研究[D]．上海：华东师范大学，2011．

[2] 田春雨，薄海美，李继安．桑椹多糖对实验性2型糖尿病大鼠血糖及血脂的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2011，17(10)：158-160．

[3] 王瑞坡,王珂，李姣，等．桑椹乙酸乙酯萃取物对链脲佐菌素致高血糖大鼠的降血糖作用[J]．中成药，2011，33(10)：1668-1672．

[4] 孙迎庆．三七总苷对糖尿病周围神经病变的影响[J]．河南中医，2009，29(12)：1234．

[5] 杜月光，柴可夫，杨明华，等．三七皂苷对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究[J]．中国中医药科技，2010，17(1)：40-41．

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[8] 中华医学会糖尿病学分会．中国2型糖尿病防治指南（2010年版）［M］．北京：北京大学医学出版社，2011：6-17．

Objective To study the effects of Compound mulberry fruit notoginseng (CMN) on blood glucose and islet pathology in streptozotocin(STZ)-induced diabetic mice. Methods Kunming mice, SPF, male, were adopted in this test. Diabetic mouse model was induced by STZ (150 mg/kg), given by intraperitoneal injection. 50 mice, whose blood glucose ranged from 11-25 mmol/L, were randomly divided in to 5 groups, such as model group, glibenclamide group(5 mg/kg) and CMN high-, middle-, low-dose group（9.0,3.0,1.5 g/kg）. Another ten normal mice were taken as control group. After administration for 30 days, diet, voided volume, weight, insulin levels, and fasting blood glucose of the mice were observed, and pancreatic β cells were immuno-stained for pathological observation. Results The results showed that there were signif i cant difference (P＜0.01 or P＜0.05) in food, water intake, voided volume, insulin levels, and fasting plasma glucose between drug group and model group. Pathological sections showed that CMN increased positive immuno-stained pancreatic β cells, and the pathological lesions improved markedly, With data， Food intake: Normal group is (5.13±0.67), Model group is (8.91±0.81), Glibenclamide group is (6.6±0.83), CMN high dose group is (4.56±0.89), CMN medium dose group is (6.63±0.49), CMN low dose group is (8.26±0.92); Water intake：Normal group is (6.21±0.59), Model group is (21.95±5.58), Glibenclamide group is (13.13±1.73), CMN high dose group is (10.19±2.00), CMN medium dose group is (13.45±2.82), CMN low dose group is (16.80±5.68)；The quantity of urine: Normal group is (4.17±0.49) , Model group is (20.31±4.97), Glibenclamide group is (11.38±1.98), CMN high dose group is (9.63±2.13), CMN medium dose group is (12.49±2.79), CMN low dose group is (15.53±5.66)；Fasting blood glucose (30 th days)：Normal group is (4.91±0.89, Model group is (20.58±6.69), Glibenclamide group is (12.71±6.60), CMN high dose group is (11.73±3.55), CMN medium dose group is (12.52±6.78), CMN low dose group is (14.28±5.57)；The serum level of insulin: Normal group is (10.12±1.27), Model group is (4.68±1.29), Glibenclamide group is (6.80±1.54), CMN high dose group is (6.23±1.62), CMN medium dose group is (5.93±1.12), CMN low dose group is (5.72±0.97)；Islet pathology score: Normal group is (2.90±0.54), Model group is (1.00±0.82), Glibenclamide group is (2.00±0.77), CMN high dose group is (2.40±0.49), CMN medium dose group is (2.10±0.83), CMN low dose group is (1.90±0.54）. Conclusion CMN signif i cantly reduces food, water intake, voided volume, insulin levels, and fasting plasma glucose on STZ-induced diabetic mice. This may be ascribe to its function of protecting the pancreatic β cells and restore the insulin secretion.

Mulberry fruit; Notoginseng; Mouse;Streptozotocin; Diabetes

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.29.004

广西国际合作项目（桂科合14125007-2-10）；广西中药药效研究重点实验室课题（10-046-04-K 6；13-051-06-K 1）

广西 530001 广西中医药大学新药研究开发中心（杜正彩） 广西中药药效研究重点实验室，广西中医药大学（邓家刚 黄庆 庞国凤 李好文）通讯作者：邓家刚 E-mail:dengjg@tom.com