大鼠骨质疏松骨折局部注射辛伐他汀对愈合的影响

冀瑞锋 韩树峰

大鼠骨质疏松骨折局部注射辛伐他汀对愈合的影响

冀瑞锋 韩树峰

目的 观察不同剂量辛伐他汀溶液对于骨质疏松大鼠股骨骨折愈合的影响。方法 3月龄健康雌性大鼠45只分为5组（n=9），手术组（A）；卵巢切除组（B）；骨质疏松骨折组（C）；骨质疏松性骨折+辛伐他汀1组（D）;骨质疏松性骨折+辛伐他汀2组（E），A组大鼠仅实施假手术不切除双侧卵巢，其余B～D组均要求切除双侧卵巢。C、D、E组在切除双侧卵巢8周后，制左侧股骨中段横行骨折模型，D组在骨折局部注射5mg/(kg·d)辛伐他汀溶液，E组注射10mg/(kg·d)辛伐他汀溶液，C组注射不含辛伐他汀的空载体，A、B组在术后8周处死，取出完整左侧股骨，其余3组在骨折造模后4周处死，并取出全部左侧股骨，测定左侧股骨的骨密度、HE染色并光镜下观察。结果 （1）切除卵巢8周后，测定B组骨密度显著低于A组（P＜0.05）。（2）骨质疏松骨折3组，C、D、E组的pBMD、mBMD、dBMD、tBMD均显著高于C组（pBMD：F=16.94，P=0.001；mBMD：F=15.57，P=0.001；dBMD：F=24.77，P=0.001；tBMD：F=23.46，P=0.001），D、E 2组中E组各部分骨密度值均高于D组，且有统计学意义（P＜0.05）。（3）形态学观察：HE染色后观察，D、E组较C组而言有较多的板层骨形成，并且D、E组中有较多量的软骨细胞存在，C组中几乎不可见板层骨存在，软骨细胞数量较少，提示D、E组较C组愈合快。结论辛伐他汀溶液皮下注射可以明显加速骨质疏松骨折愈合的进程，而且不同浓度的辛伐他汀溶液对骨质疏松骨折愈合的影响不同。高剂量明显比低剂量效果更为显著。

骨质疏松；骨折；骨折愈合；辛伐他汀

随着全球人口结构老龄化的矛盾的突显,一系列老年疾病成为困扰老年人健康的主要问题。骨质疏松作为一种老年性全身性疾病,以骨量减少,骨微结构破坏,骨韧性降低脆性增加为主要特征。骨质疏松后骨折成为最常见的并发症。骨质疏松后骨折在临床上有治疗困难,愈合较慢等一系列问题,严重影响骨折的预后及患者生活质量。有研究表明老年患者髋部骨折后第1年死亡率高于43%,5年死亡率超过75%[1]。骨质疏松骨折后内固定困难,容易出现内固定失败[2]。骨质疏松治疗中多为口服抑制骨质吸收类药物,如二磷酸盐等防治骨量进一步丢失,但骨质疏松治疗过程中服药周期长,不良反应大,患者长期服药的依从性较低[3]。目前骨质疏松治疗中主要是补充钙及维生素D连用、二磷酸盐、雌激素替代、降钙素等治疗,但并发骨折后这些药物往往不能及时快速起效促进骨折愈合。寻找有效古今骨折愈合药物是治疗骨质疏松骨折的当务之急。

近年来研究发现的常用降脂药辛伐他汀有促进成骨的作用,可以有效促进骨形态发生蛋白BMP-2的表达增强,从而有效增加骨量,减少骨量丢失[4]。本次试验尝试在骨质疏松大鼠左侧股骨骨折局部皮下注射不同浓度辛伐他汀溶液来观察其对骨质疏松骨折愈合情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备

1.1.1 试剂 辛伐他汀分散片（批号：3137185,广州市南新制药有限公司,中国）；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO,sigma公司,美国）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA,Roche公司,瑞士）；青霉素（批号：s1209409,华北制药,中国）。

1.1.2 设备 双能X线骨密度仪（DEXA,型号：Disco very-Wi,Hologic公司,美国）。

1.1.3 实验动物 3月龄的健康雌性Wistar大鼠45只（山西医科大学生理实验室提供）,体质量250～300g。

1.2 实验方法

1.2.1 辛伐他汀注射液配置 将辛伐他汀粉碎后溶解于含有2%的DMSO与0.1%的BSA的PBS混合液中[4]。浓度为

5mg/mL与10mg/mL。同时配置不含辛伐他汀的空载体,并用60Co辐照灭菌。

1.2.2 大鼠处理及分组 45只大鼠随机分为5组,每组

9只,假手术组（A）；卵巢切除组（B）；骨质疏松骨折组（C）；骨质疏松性骨折+辛伐他汀1组（D）；骨质疏松性骨折+辛伐他汀2（E）组。A组大鼠仅实施假手术不切除双侧卵巢,其余各组B～D组均要求切除双侧卵巢,术后给予大鼠肌注80万单位青霉素

BID。C、D、E组在切除双侧卵巢8周后,制股骨中段横行骨折模型。术后给予大鼠肌注80万单位青霉素BID。骨折术后当天即开始骨折局部皮下注射辛伐他汀溶液,连续皮下注射7d。D组在骨折局部注射5mg/(kg·d)辛伐他汀溶液,E组注射10mg/ (kg·d)辛伐他汀溶液,C组注射不含辛伐他汀的空载体。

A、B2组大鼠在术后饲养8周后处死,取出左侧完整股骨行DEXA检测测量左侧股骨的骨密度；其余各组于骨折模型后4周处死,取出完整左侧股骨,并对其经行DEXA检测,脱钙后石蜡包埋并HE染色做组织切片观察形态。

各组大鼠在相同环境下饲养,空气湿度为30%～40%,温度为21℃～23℃,12h.12h明暗交替环境下饲养。给予标准自由饮食,饮水为去离子水,饮食为标准固体饲料（由山西医科大学动物中心提供）。

1.3 DEXA测量 应用DEXA机器,在高分辨率模式下对各组大鼠左侧股骨经行骨密度测量,测量时取出固定用克氏针,将测量指标分为4项分别为整体骨密度值（tBMD）,股骨近端（上1/3）骨密度值（pBMD）,中段（中1/3）骨密度值（mBMD）,远端（下1/3）骨密度值（dBMD）。

1.4 骨痂组织HE染色 将左侧股骨骨折模型取出,10%多聚甲醛中固定48h,再将其取出,放入10% EDTA-2Na 缓冲液(pH7.4,4℃)脱钙,隔天更换一次缓冲液,连续脱钙2个月,待脱钙完全以后,用梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋后以

5μm为宽度经行连续切片,行HE然后后封片,并于显微镜下观察组织形态。

1.5 统计学方法 将实验所得数据采用SPSS19.0统计软件进行处理。正态计量资料采用“x±s”表示；2组正态计量数据的组间比较采用t检验。计数资料用例数（n）表示,计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验；利用单因素方差分析(ANOVA)及LSD检验比较各组之间的差异,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠死亡 B～E组切除双侧卵巢后由于术后感染,腹胀,其他不明原因造成的大鼠死亡分别为B组死亡2只,C组死亡1只,D组死亡2只,E组死亡2只。C,D,E组内固定后由于固定失败或感染等因素造成死亡分别为C组2只,D组1只, E组1只。合计A组假手术组死亡1只,B组死亡2只,C组死亡3只,D组死亡3只,E组死亡3只。

2.2 骨质疏松造模检测

2.2.1 A、B2组大鼠体质量 A组仅实施假手术手术部位及方式与B组相同,但不切除双侧卵巢,术后大鼠饮食饮水状态较差,术后2d饮食恢复正常。2组大鼠在相同环境下饲养,饲养8周后,B组切除双侧卵巢的大鼠个头明显较A组大,B组体质量也较A组有明显差异。

2.2.2 A、B2组骨密度测定 测定A/B 2组左腿的整体骨密度值,A组（0.2383±0.01000）g/cm2；B组（0.2062± 0.0158）g/cm2,B组较A组骨密度值显著降低（P＜0.05）。

2.3 骨折组骨密度及组织切片

2.3.1 骨密度值测定 C、D、E组大鼠造左侧股骨中段骨折的模型,并在骨折断端进行局部皮下给与不同浓度的辛伐他汀溶液,左股骨骨密度值：D、E组均显著高于C组（P＜0.05）；E组高于D组,差异有统计学意义（P＜0.05,见表1）。

2.3.2 组织形态学观察 在HE染色后观察,D、E组较C组而言有较多的板层骨形成,并且D、E组中有较多量的软骨细胞存在,C组中几乎不可见板层骨存在,软骨细胞数量较少,提示D、E组较C组愈合快。

表1 各骨折组骨密度（g/cm2,n=6）

3 讨论

3.1 骨质疏松及骨质疏松后骨折 世界卫生组织(WHO)关于骨质疏松症(osteoporosis,OP)的定义是：以骨量减少、骨组织微结构破坏、骨脆性增加和易于骨折为特征的代谢性骨病,其组织病理学特点是单位体积内的骨量(bone mass)降低而骨矿物质与骨基质的比例仍正常或基本正常。全球范围来说大约有超过7000万人口的骨质疏松症患者伴发有骨折的风险[4]。骨质疏松后骨质脆性增加,内固定稳定性差,临床治疗难度高。随着近年来人口老龄化程度加重,骨质疏松症及其并发骨折等一系列问题日益凸显,成为威胁老年人健康的重要因素,骨质疏松后骨折造成的致死致残率高,患者带来身体创伤和经济负担加重。

3.2 他汀类药物对骨质的作用 他汀类作为临床上广泛用于心血管疾病的预防用药。Mundy G等研究发现他汀类有促进骨质生成的新药理作用[5]。为其应用于骨质疏松治疗提供了新的途径。近年来他汀类应用于骨质疏松治疗经行了研究,并提供大量证据。Song等研究辛伐他汀可以增加雌激素受体α的数量,并可以促进BMP-2的生成[6]。宋纯理等研究发现在体外培养骨髓间充质干细胞使用辛伐他汀可以有效组织BMC成脂分化[7]。他汀类口服药物需要经过肝脏代谢,而此类药物肝脏的首过效应明显,进入血液循环的药物仅不足5%,到达骨折局部区域作用的血药浓度更低[8],通过尝试新的途径给药以寻求更有效的提高药物利用的方法。Yin H等研究表明辛伐他汀可以减轻氧化应激反应并增加NO的生成,可以减轻H2O2对于细胞的损伤并增加ALP在成骨细胞的表达[9]。近年来有多种尝试全新给药方式的研究,王晶莹等研究尝试填充物混合辛伐他汀修复骨缺损[10]。杨宁等研究表明骨质疏松大鼠股骨内单次注射辛伐他汀可以强化骨骼[11]。这些都说明辛伐他汀对于骨质形成有明显效果,本次实验采用骨折断端局部皮下注射辛伐他汀溶液,尽可能避免肝脏代谢引起的首过消除效应,加强局部断端血药浓度,从而进一步观察不同局部药物浓度对骨折愈合情况。为探索新的给药方式提供一种可能。

研究结果显示,对骨折各组间骨密度值进行比较后发现,局部注射辛伐他汀可以明显增加局部骨密度值,组织切片也显示出注射辛伐他汀有促进骨质愈合的作用。本实验条件下对于不同浓度的辛伐他汀皮下注射有较显著地促进骨质疏松骨折愈合的效果,不同剂量之间骨质疏松骨折愈合情况差异有统计学意义。

3.3 不足与展望 本实验仅就不同浓度辛伐他汀溶液局部注射对骨折愈合影响做了研究,结果提示,辛伐他汀可以有效促进骨质疏松骨折愈合,为治疗骨质疏松骨折提供可能的给药途径和剂量参考。但对于骨折局部注射在不同时间的作用效果未作进一步研究,无法明确更合理的用药周期。随着辛伐他汀后续研究进一步深入,相信在不久将来骨质疏松骨折的辛伐他汀治疗将有更广阔的应用前景。

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Objective To explore the effect of different dose simvastatin solution injected subcutaneously for femur fracture healing of osteoporotic rats. Methods Forty-five 3-mouths old female Wistar rats were randomly divided into 5 groups (n=9). Group A is the sham operation. B-E are the groups with rats which

ovariectomy. The rats in group A、B were sacrificed after 8 weeks under operation. The rats in group C, D and E were further used to establish open fracture models of femur and fixed with intramedullary nails 8 weeks after ovariectomy. C, D and E injected subcutaneously of Simvastatin solutions or vehicle (C with vehicle, D with 5 mg/(kg·d),E with 10mg/(kg·d)). The fractured rats were sacrificed 4 weeks after fracture. Bone mineral density were used to evaluate fracture healing quantitatively,and the femurs were then decalcified for HE staining and subsequent histological observation. Results The BMD of group B is significantly lower than group A after 8 weeks under ovariectomy （P＜0.05）. BMD of group D and group E are significantly increased than group C. The BMD of group E is significantly higher than group C. The rats in group D and E showed more mature callus with partially lamellar bone. The observation of histological showed the process of fracture healing of group C with vehicle was delayed. Conclusion The injection of simvastatin solutions can accelerate the process of fracture healing of osteoporotic rats. The highe dose of simvastatin solution can be more efficient than low.

Osteoporosis; Fracture; Fracture healing; Simvastatin

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.25.001

山西 030001 山西医科大学第一医院骨科（冀瑞锋 韩树峰）

韩树峰 E-mail：drhanshufeng@sohu.com