右旋糖酐40中细菌内毒素超滤去除工艺*

支兴蕾，李存玉，李红阳，陆扬，彭国平

(南京中医药大学药学院，南京 210029)

右旋糖酐40是经发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，均分子量32～42 kDa。临床常用右旋糖酐40的葡萄糖注射液或氯化钠注射液。右旋糖酐40常作为血容量扩充剂，静脉注射后能提高血浆胶体渗透压，吸收血管外水分而增加血容量，升高和维持血压［1］。它可使已经聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液黏滞性，改善微循环，防止血栓形成［2］。此外，还具有渗透性利尿作用［3］，临床的使用量较大。在其生产工艺中由于其分子量较大，无法采用超滤技术，因此目前多采用活性炭法去除其原料中的细菌内毒素污染。但是在突发污染时，由于活性炭的包合吸附特征［4］，难以保障细菌内毒素的去除效率。如果在放大膜孔径保证成分透过的同时也能有效去除细菌内毒素，则超滤法［5-7］将是一种较理想的技术，笔者在本实验中选择截留分子量为100～300 kDa，不同亲水性材质的超滤膜(聚醚砜、复合、聚偏氟乙烯)，进行右旋糖酐40的超滤工艺优选。参照2010年版《中华人民共和国药典》二部中细菌内毒素检查法中的动态浊度法，定量检测右旋糖酐40超滤前后细菌内毒素的含量，同时用高效液相色谱(HPLC)法检测超滤前后有效成分右旋糖酐40的变化情况，以去除细菌内毒素的效果和对有效成分的影响优选适宜的右旋糖酐40超滤工艺，为右旋糖酐40注射剂的生产工艺中去除细菌内毒素提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Millipore蠕动泵，复合材质超滤膜［中空纤维式，膜面积:0.5 m2，聚醚砜与聚偏氟乙烯复合，截留分子量(MWCO)=100，200，300 kDa;南京拓鉒医药科技有限公司，批号:HVF-1205010，HVF-1205020，HVF-1205030］，聚偏氟乙烯超滤膜(中空纤维式，膜面积:0.5 m2，MWCO=100，200，300 kDa;杭州水清科技环保有限公司，批号:E2009G4-10，E2009G4-20，E2009G4-30)，聚醚砜超滤膜(中空纤维式，膜面积:0.5 m2，MWCO=100，200，300 kDa;浙江润达环保科技有限公司，批号:PES-1003010，PES-1003020，PES-1003030)。BET-16M细菌内毒素测定仪、涡旋混合仪(天津市天大天发科技有限公司)。高效液相色谱仪(日本岛津):LC-10ATVP输液泵，RID-10A示差折光检测器，CTO-10ASVP柱温箱;GPC色谱工作站(天津龙智达公司)。马尔文激光粒度分析仪(Malvern ZEW3600，Malvern Instruments)。

1.2 试药 动态浊度法鲎试剂(湛江博康海洋生物有限公司，批号:1003090，λ =0.03 EU·mL－1，规格:每瓶0.6mL);细菌内毒素工作标准品(批号:150601-201174，规格:每瓶160 EU，中国食品药品检验研究院);细菌内毒素检查用水(湛江博康海洋生物有限公司，批号:0910190，规格:每瓶5mL)。右旋糖酐40对照品(中国食品药品检验研究院，批号:1179876，生化纯)。右旋糖酐40原料(北京九州天瑞科技有限公司，一级，规格:每袋 100 g，批号:58798-40-2)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备 称取适量右旋糖酐40原料，加超纯水溶解，加入一定量的细菌内毒素，煮沸，为原液，得0.1 g·mL－1右旋糖酐40 溶液。

2.2 右旋糖酐40溶液的超滤 取原液2.0 L，分别经截留分子量100，200和300 kDa的超滤膜超滤，溶液在超滤之前首先进行平衡，排除膜表面、孔径等因素对溶质的吸附影响，平衡时间以超滤液总流量的4倍药液体积，进而进行超滤，待超滤完全后，取样超滤液。并按式(1)和式(2)分别计算各药液中细菌内毒素的去除率以及有效成分的回收率。

Q(%)=(C原－C超)/C原×100%(1)。

式(1)中，Q(%)为内毒素的去除率，C超为超滤液中细菌内毒素的含量(EU·mL－1);C原为药液原液中细菌内毒素的含量(EU·mL－1)。

R'(%)=C'超/C'原×100%(2)。

式(2)中，R(%)为右旋糖酐40的回收率，C'超为超滤液中右旋糖酐40的含量;C'原为药液原液中右旋糖酐40的含量。

2.3 细菌内毒素的检测

2.3.1 标准曲线的绘制及其可靠性实验 用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品溶解并稀释，配制成细菌内毒素浓度分别为 2，0.5，0.125，0.031 25 EU·mL－1标准溶液系列，各取0.1mL，分别加到预先加有鲎试剂溶液0.1mL的反应管内，混合均匀，插入细菌内毒素定量检测仪内进行检测，其中每一浓度重复3管，并同时作阴性对照3管。以细菌内毒素浓度(C)为横坐标，反应时间(t)的对数为纵坐标，按最小二乘法进行统计分析，得标准曲线为:LogT=2.986 6－0.315 8 LogC，r=－0.992 7。结果表明，内毒素浓度在 2～0.031 25 EU·mL－1时，反应时间在840～335 7 s之间，而阴性对照管反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，故标准曲线成立。

2.3.2 干扰实验及内毒素定量测定 按公式最大有效稀释倍数(MVD)=L·C·λ1－1，L为右旋糖酐40的细菌内毒素限值(0.5 EU·mL－1)，C为1.0mL·mL－1，λ1－1为标准曲线的最低细菌内毒素浓度(0.031 25 EU·mL－1)，右旋糖酐40的最大有效稀释倍数为16倍。

根据供试品最大稀释倍数，分别将各样品药液用细菌内毒素检查用水稀释2，4，8，16倍，以此稀释液作为供试液(negative product control，NPC)，同时分别将此倍数稀释液配制成含内毒素标准品0.5 EU·mL－1的溶液，作为阳性对照(positive product control，PPC)。分别取上述溶液0.1mL加到预先加有0.1mL鲎试剂反应管内，混匀，插入细菌内毒素定量检测仪内进行检测，其中每一浓度重复2管。按照下式计算回收率:回收率(%)=(CPPC－CNPC)/λm×100%。CPPC为样品阳性对照液中细菌内毒素的含量，CNPC为样品液中细菌内毒素的含量，内毒素含量单位为EU·mL－1。λm为标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度，即0.5 EU·mL－1。当细菌内毒素的回收率在50% ～200%，则认为在此实验条件下供试品溶液不存在干扰作用。稀释浓度为2，4，8，16 倍时，回收率分别为24%，78%，105%，168%，取平均回收率在50% ～200%之间，且更接近于100%的稀释倍数时所测的内毒素值作为样品中内毒素的含量，最终选择稀释倍数为8倍，见表1。

2.4 右旋糖酐40的含量测定［8］

2.4.1 色谱条件 色谱柱:TSK-GEL G4000 PWXL柱(7.8mm × 300mm，10 μm);示差折光检测器，流动相:0.71%硫酸钠溶液;流速:0.5mL·min－1;柱温:35℃;进样量:20 μL。

2.4.2 对照品及供试品溶液的制备 取右旋糖酐40对照品适量精密称定，加超纯水溶解并定容，摇匀，配制成0.1 g·mL－1的右旋糖酐40对照品溶液。取每次超滤前原液和超滤后滤液适量作为供试品溶液待测。

2.4.3 测定法 精密吸取各供试液20 μL注入高效液相色谱仪中分析，计算各供试品中右旋糖酐40的峰面积。

2.5 右旋糖酐40溶液的粒径分布检测 原液和滤液中右旋糖酐40的粒径分布通过马尔文激光粒度分析仪检测。检测温度为25℃，分散剂为水，激光光源的波长是633 nm，水的折射率为1.330。

2.6 结果

2.6.1 细菌内毒素限值 按公式L=K/M为人的最小发热阈值5.0 EU·kg－1，M为1 h内最大给药剂量10mL·kg－1。按公式L=K/M计算得右旋糖酐40的内毒素限值为 0.5 EU·mL－1［9］。

2.6.2 细菌内毒素的去除 经3种材质、3种不同截留分子量超滤膜超滤后，各样品液中细菌内毒素的含量及细菌内毒素的去除率，见表1。

表1 超滤法去除右旋糖酐40中细菌内毒素的测定结果Tab.1 Results of removing bacterial endotoxins in dextran 40 injection by ultrafiltration

由表1可知，药液经单一材质的PES和PVDF超滤膜超滤后，细菌内毒素的含量仍然很高，PES超滤膜内毒素去除率低于20%，PVDF超滤膜地去除率仅约36%。而药液经复合材质的3种孔径超滤膜超滤后，内毒素含量均大幅度降低，低于注射剂中的限值0.5 EU·mL－1，去除率达到 99%，3种孔径的膜都能很好地去除右旋糖酐40溶液中的内毒素，有效地将热原污染严重的右旋糖酐40溶液中的细菌内毒素控制在低水平，达到注射用级别。

2.6.3 右旋糖酐40的透过率 经截留分子量100，200及300 kDa的3种材质超滤膜超滤后，右旋糖酐40的透过率见表2。

表2 右旋糖酐40的透过率Tab.2 Transmittance of dextran 40

分析表2数据可知，经复合材质的分子量300 kDa超滤膜超滤后，右旋糖酐40溶液中的右旋糖酐透过率＞93%，说明该孔径超滤膜对右旋糖酐基本无影响;但经分子量100和200 kDa该材质的超滤膜超滤后右旋糖酐损失严重，透过率只有54.77%和77.31%。PES和PVDF超滤膜超滤药液后，随着膜孔径的增大，右旋糖酐40的透过率相应增加，孔径增大到分子量300 kDa时，右旋糖酐40的透过率均＞91%，说明不同材质的大孔径超滤膜对右旋糖酐40的超滤适用性较好。

2.6.4 超滤前后溶液的平均粒径分布 右旋糖酐40原液和经分子量300 kDa复合材质超滤膜超滤后药液的粒径分布图，见图1，2。原液和滤液的粒径均分布约在10 nm，但原液的平均粒径为10.7 nm，超滤液平均粒径为7.9 nm。超滤后的右旋糖酐40溶液的平均粒径降低，分布范围偏窄，同时结合表2中数据可知，300 kDa超滤膜处理后右旋糖酐40损失＜10%，说明超滤后的右旋糖酐40中的大分子杂质得到了较好的去除。

2.6.5 复合超滤膜耐受性 称取适量右旋糖酐40原料，加超纯水溶解至10 L，选择膜面积为0.5 m2，截留分子量为300 kDa的复合材质超滤膜进行耐受性实验，在操作压力为0.2 MPa下，考察膜通量与药液循环体积之间的相关性。结果发现，在药液总循环药液量达到60 L时，膜通量下降基本稳定，说明膜表面已经形成了凝胶层，见图3。

图1 右旋糖酐40原液粒径分布图Fig.1 Particle size distribution of detran 40 injection

图2 分子量300 kDa复合材质膜超滤后滤液粒径分布图Fig.2 Particle size distribution of detran 40 ultrafiltrated by 300 kDa composite material membrane

图3 分子量300 kDa复合超滤膜耐受性实验Fig.3 Tolerance test of 300 kDa composite material membrane

3 讨论

右旋糖酐40经过发酵生产，所以其注射用原料中尚存在一些分子量偏大的聚合物或杂质，笔者以超滤技术中的分子筛分分离原理对右旋糖酐40中大分子物质进行了较好的去除，且主成分损失不明显。

在注射剂生产中常采用活性炭去除内毒素结合微滤除菌，此方法很难应对内毒素的突发性污染。本实验用超滤法去除药液中热原，并比较复合材质和单一材质PES和PVDF两种膜的超滤效果。对于糖类的大分子物质进行超滤去内毒素，单一材质的 PES和PVDF超滤膜效果较差，这可能是由于热原在单一膜材质表面多以单分子或小分子的内毒素存在，容易通过大孔径的超滤膜;而经截留分子量300 kDa复合材质的超滤膜聚对右旋糖酐40溶液超滤时，内毒素在膜表面容易以团聚的形式存在，并被膜孔截留，从而呈现内毒素去除率好的同时，右旋糖酐40透过率也较高。因此，采用分子量300 kDa特制的复合材质的超滤膜适于右旋糖酐40这类大分子注射剂生产中的内毒素的去除，可提升制剂质量。

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