微波热疗增强视网膜母细胞瘤化学治疗效应的体外研究△

陈华艳 尹延彦 叶凡 常俊标 王蕾

微波热疗增强视网膜母细胞瘤化学治疗效应的体外研究△

陈华艳 尹延彦 叶凡 常俊标 王蕾

微波热疗；视网膜母细胞瘤；化疗；阿霉素

目的研究微波热疗对提高阿霉素(doxorubicin，DOX)体外抑制人RB Y79细胞的作用。方法分别使用MTT法、荧光显微镜、流式细胞仪检测人RB Y79细胞的存活率、摄取及凋亡情况；使用分光光度法检测Y79细胞内Caspase-3的活性。将实验分为空白对照组、DOX组、微波热疗组、DOX+微波热疗组，分别将4组进行以上细胞实验。结果DOX+微波热疗组与其他组相比细胞存活率明显下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。细胞荧光摄取实验表明，DOX+微波热疗组与DOX组相比，其细胞穿透效果在60 min内呈明显上升趋势。DOX+微波热疗组72 h细胞凋亡率可达(49.08±1.02)%，可有效促进细胞凋亡，与其他各组相比差异有明显统计学意义(均为P<0.01)。同时，DOX组、微波热疗组、DOX+微波热疗组、空白对照组人RB Y79细胞的Caspase-3活性分别为2.88±0.16、1.61±0.09、4.67±0.27、1.00±0.05，微波热疗+DOX可以有效提升细胞内Caspase-3活性，与其余各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论微波热疗可以有效提高人RB Y79细胞体外化学治疗的效果，此疗法是一种很有前景的治疗视网膜母细胞瘤的方法。

[眼科新进展，2014，34(7):620-623]

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是一种起源于视网膜胚胎性核层细胞的恶性肿瘤，也是婴幼儿时期眼内恶性程度最高的肿瘤[1]。RB经过早期保守治疗后生存率可显著提高[2]。目前，RB常用的治疗手段主要有放射疗法、化学疗法、分子基因疗法等[3-5]。热疗是近年发展起来的一种治疗癌症的新方法，是利用外加能量使肿瘤温度上升至有效治疗温度杀灭肿瘤细胞。阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前临床常用的一种广谱抗癌药，具有热疗增敏性和pH敏感性[6]。研究表明，热疗与化学治疗联合可以起到协同增效的作用[7]。本实验旨在探讨微波热疗对RB Y79细胞的DOX化学治疗增敏作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器DOX(美国Aldrich Sigma公司)、DMEM培养基(美国Hyclone公司)、胎牛血清(四季青公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Hyclone公司)、细胞凋亡试剂盒(碧云天生物技术研究所)、人 RB Y79 细胞(美国模式培养物集存库)。酶标仪(加拿大DYNEX公司)、流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)、UHR-2000高能聚束微波热疗机(华源医疗设备有限公司)、高效液相色谱仪(岛津公司)。

1.2细胞培养将RB Y79细胞培养在含体积分数15%胎牛血清、体积分数1%双抗的DMEM培养基中。细胞培养箱条件为37 ℃、含体积分数5% CO2。细胞接种24 h后，使用工作浓度的DOX与培养基混合液作为细胞培养液，在42 ℃条件下微波加热2 h，然后继续培养24 h、48 h或72 h。

1.3DOX工作浓度测定DOX设0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、1.000 mg·L-1、2.000 mg·L-1、4.000 mg·L-1、8.000 mg·L-17组，每组3个复孔，使用MTT法测定细胞抑制率，以48 h的IC50为工作浓度。

1.4MTT法测定细胞增殖率将RB Y79细胞以每孔5.5×103个接种到96孔培养板中，每组设3个复孔，培养时间分别为24 h、48 h、72 h。实验组分为空白对照组、DOX组、微波热疗组和DOX+微波热疗组(使用工作浓度的DOX与培养基混合液作为细胞培养液，在42 ℃条件下微波加热2 h)。终止培养前4 h，每孔加MTT 10 μL。4 h后，每孔加入150 μL三联液，室温孵育过夜。第2天，全自动定量绘图酶标仪测定每孔的 570 nm 波长吸光度(A)值，重复测量3次。计算公式:细胞存活率=(1-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.5DOX细胞荧光摄取检测将密度为0.15×106个/孔的Y79细胞接种于6孔板中，培养24 h后，分别加入1.3 mg·L-1DOX进行刺激(此浓度为IC50计算出的浓度)，同时设定空白对照组、微波热疗组、DOX组及DOX+微波热疗组，于37 ℃培养箱中继续培养。每组分别培养5 min、30 min、60 min。培养完毕后，弃培养液，PBS冲洗后并固定细胞，置于荧光显微镜下检测。

1.6细胞凋亡率检测分组方法参照1.5，于37 ℃培养箱中继续培养24 h后，使用PBS洗涤3次；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混匀；再加入5 μL Propidium Iodide，混匀，室温、避光反应5～15 min；1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7Caspase-3活性检测分组方法参照1.5，于37 ℃培养箱中继续培养24 h后，将细胞重新悬浮于 50 μL冷细胞裂解缓冲液中，冰上放置10 min。4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。将上清转移至另一离心管中，置于冰上。向每组加入50 μL的2×反应缓冲液/二硫苏糖醇(DTT)混合液。向每管加入5 μL 1 mmol·L-1Caspase-3底物，水浴37 ℃孵育1 h。在405 nm波长下读取A值。根据试剂盒说明所得斜率值计算 Caspase-3活性。

1.8统计学方法应用SPSS 17.0软件进行数据处理，结果采用均数±标准差表示，采用单向方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DOX工作浓度的确定MTT法检测结果显示，0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、1.000 mg·L-1、2.000 mg·L-1、4.000 mg·L-1、8.000 mg·L-1DOX分别作用于人RB Y79细胞后，各组细胞抑制率分别为(3.56±0.29)%、(9.74±0.91)%、(26.88±2.31)%、(34.75±3.24)%、(59.62±4.28)%、(76.71±4.54)%、(95.04±5.27)%。人RB Y79细胞对DOX的IC50为1.3 mg·L-1，并以此药物浓度进行各项实验。

2.2各组细胞的增殖率细胞分别培养24 h、48 h及72 h后，抑制率出现明显变化(表1)。DOX+微波热疗组与空白对照组相比，24 h、48 h及72 h差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)；与微波热疗组相比，24 h差异有统计学意义(P<0.05)，48 h及72 h时差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)；与DOX组相比，24 h、48 h及72 h差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

表1 各组人RB Y79细胞存活率Table 1 Cell viability for human RB Y79 cells(±s，rate/%)

2.3微波热疗促进细胞对DOX的摄取经微波热疗处理后，细胞内DOX的荧光明显增强。在60 min中人RB Y79细胞中没有明显的红色荧光，但是经过微波处理后的细胞在微波热疗5 min后，就开始有红色荧光出现。60 min时已经可以看到细胞内明显的红色荧光(图1)。结果表明，微波热疗可以提高人RB Y79细胞对DOX的穿透及蓄积能力。

Figure 1 Fluorescent microscopic images of cells in DOX group and DOX combined with microwave treatment(×400) DOX组及DOX+微波热疗组的细胞明场及荧光图片(×400)

表2 人RB Y79细胞在24 h、48 h和72 h的凋亡率Table 2 Apoptotic rate of human RB Y79 cells at 24 hours,48 hours and 72 hours(±s)

2.4微波热疗促进DOX化学治疗对细胞的凋亡DOX组、微波热疗组及DOX+微波热疗组细胞凋亡率均较空白对照组明显升高(均为P<0.01，见表2)；DOX+微波热疗组的细胞凋亡率较DOX组、微波热疗组的凋亡率均有明显升高(均为P<0.01)。

2.5微波热疗诱导人RBY79细胞中的Caspase-3的作用按照实验操作处理24 h后，DOX组、微波热疗组、DOX+微波热疗组、空白对照组人RB Y79细胞的Caspase-3活性分别为2.88±0.16、1.61±0.09、4.67±0.27、1.00±0.05，DOX+微波热疗组人RB Y79细胞的Caspase-3活性增强，与其余各组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

3 讨论

DOX是目前临床常用的一种广谱抗癌药，可用于多种肿瘤的治疗[8-10]。DOX在进行肿瘤化学治疗时具有明显的热疗增敏性和pH敏感性，将热疗与化学治疗联合应用可以对化学治疗起到增效作用[11]。肿瘤组织及其周围血管对温度具有敏感性，利用微波热疗的方法可有效将其杀灭[12]。近年来，肿瘤热疗受到了人们的广泛关注。同时，热疗和化学治疗联合治疗肿瘤具有明显的增强作用，其原因可能是热疗使药物渗入细胞量增加、蛋白质变性及化学治疗药物的药动学改变等。本研究探讨了微波热疗对DOX进入细胞的促进作用，结果表明，经过微波和DOX共同作用的细胞，在作用5 min后，细胞内就出现明显的荧光，表明微波热疗可以有效促进DOX快速进入靶细胞。

研究者认为热疗杀灭细胞的临界温度为42 ℃[13]，目前临床所使用的热疗温度多数在41～43 ℃之间，因此本研究中微波热疗的处理温度设定为42 ℃。张福明等[6]使用KG-1a细胞研究了热疗对DOX治疗的增敏作用，发现热疗可以增加DOX对KG-1a细胞的杀伤作用，提高肿瘤细胞的凋亡率，结果表明40 ℃、42 ℃热疗联合化学治疗组的细胞抑制率明显高于化学治疗组和单纯热疗组(均为P<0.01)。各处理组的细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01)，40 ℃、42 ℃热疗联合化学治疗组细胞凋亡率明显高于化学治疗组和单纯热疗组(均为P<0.01)。王向军等[14]研究了DOX对U251神经胶质瘤细胞在热疗条件下的增敏作用，结果表明热疗联合DOX化学治疗能增强对U251细胞的体外抑制作用，提高肿瘤细胞的凋亡率，通过联合热疗有效下调P-gp及Bcl-2蛋白的表达，提高U251细胞对DOX化学治疗的敏感性。以上实验均证明DOX本身具有热疗增敏特性，但是热疗的方法与本研究不同，本研究使用的是微波热疗。实验结果表明，在联合微波热疗的条件下，DOX可迅速进入细胞内部，促进细胞凋亡。此热疗方法与其他热疗方法相比优势明显:首先此热疗方法已用于临床肿瘤的相关治疗；其次，微波热疗法可以有效穿透人体组织，达到治疗人体深层肿瘤的目的；并且，此热疗法可使病变部位快速达到指定温度，从而减少患者的痛苦。

本研究结果表明，微波热疗不仅可以有效促进DOX快速进入细胞内部，并且可以有效协同DOX增强细胞抑制率，促进细胞凋亡。凋亡是由Caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，即Caspase在凋亡诱导信号的作用下，启动型Caspases先通过结合特异辅因子激活，发挥水解蛋白的作用，从而激活下游效应型Caspases，一旦效应 Caspases被激活，便大范围水解细胞内的靶物质，从而降解细胞内蛋白，最终使细胞进入不可逆死亡阶段[15]。Caspase-3是白细胞介素 1-β转化酶家族成员之一，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在细胞凋亡过程中占据核心地位，被称为“死亡执行蛋白酶”[16]。活化后的Caspase-3酶解切割DNA依赖的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，从而影响DNA复制、转录和损伤修复[17]。本研究通过对人RB Y79细胞中Caspase-3活性的考察，探讨了微波热疗对Caspase-3活性的促进作用，抗肿瘤机制的重点是使细胞产生凋亡，而激活Caspase-3在肿瘤凋亡作用中具有重要意义。

本研究不仅证实了微波热疗对DOX体外抗肿瘤的协同作用，可以有效协同DOX抑制Y79细胞的增殖，并且能有效促进细胞的凋亡，提高了Y79细胞对DOX化疗的敏感性，这为RB的治疗提供了一种有效的治疗手段。

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date:Dec 7，2013

Youth National Nature Science Foundation of China(No:81302717)From theSchoolofBasicMedicine，ZhengzhouUniversity(CHEN Hua-Yan)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity(YIN Yan-YannowworksattheDepartmentofPublicHealth，XinxiangMedicalUniversity)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；SchoolofPharmaceuticalSciencesofZhengzhouUniversity(YE Fan)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；SchoolofChemistryandMolecularEngineering，ZhengzhouVnirersity(CHANG Jun-Biao),Zhengzhou450001,HenanProvince,China;SchoolofChemistryandMolecularEngineering，SchoolofPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity(WANG Lei)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China

Microwave hyperthermia enhancing chemotherapeutic efficacy in retinoblastoma cells in vitro

CHEN Hua-Yan，YIN Yan-Yan，YE Fan，CHANG Jun-Biao,WANG Lei

microwave hyperthermia；retinoblastoma；chemotherapy；doxorubicin

ObjectiveTo study the ability of microwave hyperthermia in enhancing chemotherapeutic efficacy of doxorubicin (DOX) against human retinoblastoma Y79 cellsinvitro.MethodsMTT method was used to detect the viability of Y79 cells,cellular uptake of Y79 cells was determined by fluorescence microscopy,cell apoptosis was detected by flow cytometry,and spectrophotometric method was used to detect the expression of Caspase-3 in Y79 cells.The experiments were divided into 4 groups:blank control group,DOX group,microwave treatment group and DOX combined with microwave treatment group,and these groups were experimented,respectively.ResultsThe Y79 cells exposed to DOX with microwave treatment showed a significant decrease in cell viability which compared with other groups (allP<0.05).The cellular uptake results showed that the cells increased permeability to DOX immediately with the addition of microwave compared with DOX alone,which continued to increase over 60 minutes.Apoptotic rate of cells treated with DOX and microwave hyperthermia was (49.08±1.02)%,and it could enhance the apoptosis rate compared to other experimental groups (allP<0.01).Meanwhile,the activity of Caspase-3 in cells of blank control group,DOX group,microwave treatment group and DOX combined with microwave treatment group were 2.88±0.16,1.61±0.09,4.67±0.27 and 1.00±0.05,respectively,DOX with microwave treatment could enhance the activity of Caspase-3 in cells,there were statistical differences compared with other groups (allP<0.05).ConclusionMicrowave hyperthermia can enhance the chemotherapeutic efficacy against retinoblastoma Y79 cellsinvitro,DOX combined with microwave treatment is a promising approach for retinoblastoma.

陈华艳，女，1969年7月出生，实验技师。联系电话:15136400500；E-mail:15136400500@139.com

AboutCHENHua-Yan:Female，born in July，1969.Tel:1513640-0500；E-mail:15136400500@139.com

2013-12-07

国家自然科学基金青年基金项目(编号:81302717)

450001 河南省郑州市，郑州大学基础医学院(陈华艳)；450001 河南省郑州市，郑州大学公共卫生学院(尹延彦现工作于新乡医学院公共卫生系)；450001 河南省郑州市，郑州大学药学院(叶凡)；450001 河南省郑州市，郑州大学化学与分子工程学院(常俊标)；450001 河南省郑州市，郑州大学化学与分子工程学院、郑州大学药学院(王蕾)

王蕾，E-mail:hahalei@139.com

陈华艳，尹延彦，叶凡，常俊标，王蕾．微波热疗增强视网膜母细胞瘤化学治疗效应的体外研究[J]．眼科新进展，2014，34(7)：620⁃623．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0170

【实验研究】

修回日期:2014-03-10

本文编辑:付中静

Accepteddate:Mar 10，2014

Responsibleauthor:WANG Lei，E-mail:hahalei@139.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):620-623]