白芷愈伤组织中总香豆素的提取与测定

梁玉玲，鲜于梁艳，陈子龙

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技术研究中心，河北 保定 071002）

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.Ex Hoffm.）Benth.et H－ook.f.的干燥根［1］.白芷的有效成分主要是挥发油和多种香豆素类成分.香豆素类化合物是一类具有苯骈－α－吡喃酮结构骨架的化合物，其中线性香豆素类化合物为光敏活性物质［2］，香豆素类化合物含量的高低是中药白芷品质评价的重要指标之一［3］.香豆素类化合物还具有抗菌消炎、镇痛、抗肿瘤［4－6］等功效.目前，白芷药材中有效成分的提取测定工艺已较为完善，但是基本没有以白芷愈伤组织为材料提取香豆素类有效成分的研究.本实验室通过组织培养的方法诱导出大量白芷愈伤组织，而且对白芷愈伤组织中总香豆素的提取及质量分数的测定进行了相关研究，为药用植物白芷的植物生物技术开发和利用奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

白芷（A.dahurica）愈伤组织，由本实验室诱导.市售白芷药材购自河北安国药材市场.

1.2 仪器与试剂

KH2200DB型数控超声波清洗器（昆山市禾创超声仪器有限公司）；UV／2802SH 型紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；Eppendorf 5804R 型离心机（Eppendorf 公司）；欧前胡素标准品（批号MUST－12062105）购自成都曼思特生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯.

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

精密称取欧前胡素标准品3.000mg，甲醇溶解定容至100mL即为标准品母液，精密吸取欧前胡素标准品母液1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mL，分别用甲醇定容至10mL.以甲醇为空白，于300nm 处测定吸光值，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制欧前胡素标准曲线.

1.3.2 白芷愈伤组织中总香豆素的提取

精密称取白芷愈伤组织粉末0.200g，放入50 mL 离心管中，以乙醇为溶剂，按照4 因素3 水平进行L9（34）正交实验，因素水平见表1.提取液10 000r／min离心10min，取上清液，40℃水浴挥干至无醇味，加甲醇定容至100mL，即得样品溶液，于300nm 处测定吸光值，并根据回归直线方程计算总香豆素的质量分数，计算公式如下：

总香豆素的质量分数＝100ρ×10－3／m，

其中：ρ为由回归直线方程求得的香豆素质量浓度（μg／mL）；m 为待测样品的质量（g）.

表1 正交实验因素水平Tab.1 Factor levels of orthogonal experiment

1.3.3 数据统计

实验中的正交优化结果分析采用Orthogonality Experiment Assistant II软件进行数据分析，并采用其分析结果.

2 结果与分析

2.1 总香豆素质量分数的测定

2.1.1 测定波长的选择

在200～400nm 内分别扫描欧前胡素标准品及样品溶液，两者在300nm 处均有1个吸收峰，峰形变化平缓，便于定量测定，因此，将300nm 作为本实验中欧前胡素的测定波长.

2.1.2 线性关系

精密吸取欧前胡素标准品母液1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mL，分别用甲醇定容至10mL.以甲醇为空白，于300nm 处测定吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为A＝0.049 4ρ－0.001 7（R＝0.999，n＝10）.结果表明，欧前胡素标准品溶液质量浓度在3.0～30.0μg／mL 内线性关系良好.

2.1.3 重复性实验

精密称取白芷愈伤组织粉末各0.200g，按1.3.2方法制备7份样品溶液，平行测定，平均质量分数分别为6.940，6.944，7.028，7.090，7.136，7.139，6.920mg／g，RSD＝1.600%（n＝7），表明此测定方法重复性良好.

2.1.4 精密度实验

取2.1.3项7号样品溶液，于300nm 处连续测定7 次，平均质量分数分别为6.991，6.991，6.991，6.988，6.988，6.988，6.991mg／g，RSD＝0.025%（n＝7），结果表明精密度良好.

2.1.5 稳定性实验

取2.1.3项下7号样品溶液，于300nm 处测定吸光度，每隔30min 测定1 次，连续测定7 次，平均质量分数分别为6.920，7.035，7.126，7.173，7.203，7.193，7.134mg／g，RSD＝1.900%（n＝7），结果表明样品在3h 内稳定性良好.

2.1.6 加样回收实验

取已知香豆素质量分数的白芷愈份组织样品约0.100g，精密称定，分别加入相当于样品中香豆素质量的80%，100%，120% 的欧前胡素标准品，按样品溶液制备方法操作.测定结果，其回收率为98.47%，96.86%和98.76%，RSD＝2.400%（n＝3）.

2.2 样品中总香豆素质量分数的测定

利用紫外分光光度法分别测定不同提取条件下白芷愈伤组织中香豆素类有效成分的质量分数，其结果见表2.

表2 L9（34）正交实验结果Tab.2 Results from orthogonal experiments arranged on L9（34）

2.2.1 极差分析

由正交实验直观分析表（表3）可以看出，4种因素对白芷愈伤组织中总香豆素提取的影响为超声时间（A）＞溶剂pH（C）＞超声温度（B）＞溶剂体积分数（D）.对于每种单因素，分析出其较优水平，分别为A2，B3，C3，D1.

表3 L9（34）正交实验直观分析Tab.3 Intiutive analysis of L9（34）orthogonal test

2.2.2 方差分析

由方差分析结果（表4）可知，各因素对香豆素的质量分数的影响无显著性差异（P＞0.05）.可能是由于本实验误差大，或者自由度小，使检验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性.由于实验结果的显著性不高，所以对本实验进行了进一步的验证性实验，以证明该实验条件是否为最优方案.

表4 L9（34）正交实验方差分析Tab.4 Variance analysis of L9（34）orthogonal test

2.3 最优组合验证实验

取0.200g白芷愈伤组织粉末，按照最优组合进行超声提取，即料液比（粉末g:溶剂mL）为1:15，乙醇的体积分数为60%，溶剂pH 为9，超声时间为30min，超声温度为70℃，超声功率为100W.通过紫外分光光度法测定其总香豆素的质量分数.重复进行3 次实验，平均质量分数为12.328，12.371，12.291 mg／g，RSD＝1.500%（n＝3），显示结果稳定，证明了本实验所确定的白芷愈伤组织中总香豆素提取的最优组合的可行性.综上所述，确定白芷愈伤组织中总香豆素提取的最佳组合条件为A2B3C3D1，即超声时间为30min，超声温度为70 ℃，溶剂pH 为9，溶剂乙醇的体积分数为60%.

2.4 白芷药材中总香豆素的质量分数测定

将作为平行对照的白芷药材捣碎研磨成粉末，按照愈伤组织总香豆素的提取方法进行提取测定.作为平行对照的白芷药材中总香豆素的质量分数（表5），3次独立重复实验结果显示白芷药材中总香豆素的质量分数仅为1.269mg／g，而白芷愈伤组织中总香豆素的质量分数为12.330mg／g，是白芷药材中总香豆素质量分数的9.7倍.

表5 白芷药材中总香豆素的质量分数Tab.5 Mass fraction of the total coumarin in Angelica dahurica medicinal materials

3 讨论

目前，市场上所用的白芷都是白芷的干燥根部分，但是无论是野生资源，还是人工种植资源都在一定程度上耗时较长，而且在种植过程中，受到外界条件的影响相当大.而白芷愈伤组织的生长量巨大，有培养时间短、条件易控制、不受季节影响、不占用农田、质量稳定等优点.同时，通过本实验证实，本实验室诱导培养的白芷愈伤组织中总香豆素的质量分数是白芷药材中总香豆素质量分数的9.7倍，而且完全能够达到《中国药典》中不得少于0.080%的要求［1］.所以通过组织培养得到大量白芷愈伤组织，并从中提取白芷有效成分，将会为白芷的药理作用的研究提供相应的实验基础.

已报道的白芷总香豆素的提取方法主要有CO2超临界萃取法［7］、回流法［8］、渗漉法［9］和高速逆流色谱方法［10］.CO2超临界萃取法和高速逆流色谱方法一样，由于两者成本都相当高，在实际应用中并不是很广泛.渗漉提取耗时较长，而回流提取时提取液长时间加热，易造成有效成分的分解.研究表明超声提取法可加速药物有效成分进入溶剂，可以缩短提取时间，提高提取率，节约溶剂，并且免去了高温对提取成分的影响［11］，是适用于中药材有效成分提取的新工艺.用超声提取技术来进行白芷愈伤组织有效成分的提取是本实验所选用的方法，但在使用超声波进行成分提取时，应注意选择合适的超声条件，并根据提取物质的特性进行选择，以免破坏所需提取物的结构及稳定性.

马逾英［12］和何珊珊［13］等的研究表明，白芷的提取物的最大吸收波长均在300nm 左右.本实验在200～400nm 分别扫描欧前胡素标准品及样品溶液，两者在300nm 处均有1个吸收峰，因此，将300nm 作为测定波长.本实验利用了欧前胡素为指示性成分，测定了白芷中总香豆素类有效成分的质量分数，但是对于白芷中总香豆素类成分的具体种类和质量分数还有待进一步研究.

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