炼油废水生化处理稠油降解菌的筛选研究

茅新华 何 军 彭 卫

(1.中国石油工程建设公司拉克分公司，北京 100120；2.中国石油乌鲁木齐石化分公司，新疆 乌鲁木齐 830019)

0 前言

利用微生物处理石油废水是一项具有广阔前景的高新技术。本实验从石化炼油厂曝气池废水中分离筛选出以石油为唯一碳源的降解菌，初步鉴定了菌株的特性，并研究了影响其降解石油能力的因素，为炼油厂废水处理等应用奠定了基础。

1 概述

1.1 目前研究概况

据统计，迄今为止，已经发现能够降解石油的微生物有200多种，其中细菌有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)等[1]。已经分离筛选出能降解原油的菌种有：Rhodococcus rhodochrous，Pseudomonas，Alicaligenes，Rhodococcus erythropolis，Acinetobacter，Devouroil等，能够降解芳香烃的菌有：Aeromona，Alicaligenes，Bacillus，Corynebacteria，Flavobacterium，Micrococcus，Mycobacterium，Nocardia，Pseudomonas，Rhodococcus等[2,3]。但这些研究工作，大多以分离鉴定石油烃及其相应化合物的微生物类型和分布出发，以及微生物降解土壤和海洋中原油的能力方面[4-6]，缺乏利用筛选的微生物来处理炼油工业废水等实际应用方面的进一步研究。

1.2 实验技术路线

采集曝气池废水→预处理、制备稀释样品→原油培养基涂布(32℃，培养7-10天)→分离、纯化(纯化培养基)→细菌形态鉴定(形态、革兰氏染色)→初步降解效果实验(研究培养时间、pH、接种量、菌龄对降解率的影响)→菌种保藏 (试管斜面、4℃冰箱)

2 实验方法

2.1 菌种筛选

取曝气池废水1mL，加入灭菌的(121oC、高压蒸汽灭菌15-20min)100mL原油液体培养基中，32oC，转速120r/min摇床培养96h。待培养液混浊后，吸取1mL培养液转接入灭菌的100mL的原油液体培养基中，32oC继续摇床培养96h。取1mL该富集液，按10-1、10-2、10-3的梯度稀释后。分别取0.1mL涂布于原油固体培养基平板上。于32oC培养7天后，在生长状况良好的平板上挑选长势最好的单菌落，在纯化培养基平板上分离、纯化，反复分离纯化直到获得单一菌株为止，即获得以石油为唯一碳源的菌株。

2.2 菌种特征

在纯化培养基平板上分离、纯化，获得了两种不同的菌株，革兰氏染色均为阴性。分别标记为T-1，T-2。石油降解菌的特征，如表1所示。

表1 石油降解菌的特征

2.3 培养时间对降解率的影响

取6个250mL的三角瓶，分别装入100mLpH为7.0的原油液体培养基，121oC，高压蒸汽灭菌15min,自然冷却至室温。将活化24h的菌株配制成菌悬液，向其中的5个三角瓶中分别接种1.0mL菌悬液，1瓶不接菌的作为对照。32oC，转速120r/min摇床培养，在培养12h、24h、48h、72h、96h后分别测定其去油率。

去油率的测定方法：分别向每个三角瓶中加入60mL氯仿，充分萃取。取2mL有机层(下层)萃取液，用氯仿稀释150倍，以氯仿为空白，在250nm处测定其吸光值，然后计算去油率。

2.4 pH对降解率的影响

将活化24h的菌株配制成菌悬液，取1.0mL菌悬液分别接种到已灭菌的pH依次为3、5、6、7、8、9的100mL原油液体培养基(250mL三角瓶)中，不接菌的作为对照。32oC，转速120r/min摇床培养，培养48h后分别测定其去油率，方法同2.3。

2.5 接种量对降解率的影响

将活化24h的菌株配制成菌悬液，分别取0.1mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL菌悬液(1.2×106个/mL)，依次接种到已灭菌的pH为7.0的100mL原油液体培养基(250mL三角瓶)中，不接菌的作为对照。32oC，转速120r/min摇床培养，培养48h后分别测定其去油率，方法同2.3。

2.6 菌龄对降解率的影响

将活化12h、24h、48h、72h、96h的菌株配制成菌悬液，各取1.0mL菌悬液分别接种到pH为7.0的100mL原油液体培养基(250mL三角瓶)中，不接菌的作为对照。32oC，转速120r/min摇床培养，培养48h后分别测定其去油率，方法同2.3.4。

2.7 菌种保藏

把本实验所获得的对原油有降解能力的菌株进行保藏，用纯化培养基接试管斜面，在32℃下培养24h后，保藏于4℃冰箱。

3 结果与分析

3.1 菌种的获得

将分离纯化获得的两种菌株，分别进行初步石油降解实验，其中菌株T-1的降解率较高，故以T-1作为本实验所用的菌株。

3.2 菌株降解率的测定

图1 培养时间对降解率的影响

图2 pH对降解率的影响

由图1可见，培养时间的变化，对去油率也有一定的影响。在12-48h时间段，随着培养时间的延长，去油率逐渐增加。在摇床培养期间可以明显观察到石油的乳化现象，菌体与油滴形成了大量的絮状小球，使菌体能充分和石油接触，从而提高了其降解效率。在48-96h时间段，去油率呈现缓慢下降的趋势，可能是由于菌种老化，活力降低等因素，导致了去油率的降低。

由图2可见，原油液体培养基的pH不同，对去油率也有很大的影响。pH在6-8的范围内，都呈现了较好的降解能力，在pH7.0时，降解效果最好，去油率为33%，可见pH过高或者过低都不利于对原油的降解。因此，以下实验均在pH7.0的条件下进行。

图3 接种量对降解率的影响

由图3可见，接种量的变化，对去油率也产生了较大的影响。随着接种量的增大，去油率逐渐增加。当接种量为2mL(1.2×106个/mL)时，去油率达到了47.4%，可能是菌浓度比较低，降解菌数量少，去油率低；当浓度增大时，由于降解菌密度大大增加，去油率明显增大。

由图4可见，接种菌的菌龄越大，去油率就越低。接种菌的菌龄为12h时，有最好的降解效果，去油率可达41.8%。培养时间过长，由于菌种老化，表面活性降低，对石油的乳化能力变弱，从而导致了去油率的降低。

图4 菌龄对降解率的影响

4 结论与讨论

4.1 结论

(1) T-1菌株能以石油为唯一碳源生长，并对原油具有较好的降解效果。

(2) 研究结果表明：T-1菌株对原油的降解受培养时间、pH、接种量、菌龄等因素的影响。培养时间为48h时，去油率达49.2%；pH7.0时，去油率为33%；接种量为2%(细菌数1.2×106个/mL)时，去油率为47.4%；菌龄为12h时，去油率为41.8%。

4.2 讨论

4.2.1 存在问题

(1) 从炼油厂曝气池含油废水中分离、筛选出以原油为唯一碳源的菌株，并初步研究了其对石油的降解能力,在实验室条件下降解率可达49.2%，若应用于炼油废水处理，还有待于进一步的驯化、筛选。

(2) 在研究影响石油降解率因素的实验中，由于筛选、纯化菌株时温度均为32oC，所以在测定降解率时，各组实验都在32oC下进行。因此没有考虑温度对降解率的影响，但有文献报道[7]，温度对降解率也有一定的影响。

(3) 含油量的多少对降解率也有一定的影响[8]，由于时间有限，本实验没有研究不同含油量对降解率的影响。

4.2.2 展望

目前，利用微生物处理含油废水面临重重困难，筛选、驯化能用于处理石化企业含油废水的高效降解菌也有一定的难度。但该方法费用低、而且不会造成二次污染。因此，这是一项具有广阔前景的高新技术，相信该技术替代传统的处理方法不久将会变为现实。

[1]马文漪, 杨柳燕.环境微生物工程[M]. 南京: 南京大学出版社.1998, 128-131.

[2]王晓娟, 顾宗镰. 机油降解菌的筛选及其降解能力的研究. 复旦学报(自然科学版), 2001, 40(5): 562-567.

[3]Li Wang, Suzelle Barrington, Jin-Woo Kimb. Biodegradation of pentyl amine and aniline from petrochemical wastewater. Journal of Environmental Management, 1999, 16: 158-165.

[4]奚旦立, 孙裕生, 刘秀英编.环境检测(修订版).北京: 高等教育出版社, 1995, 406-407.

[5]U.J.J. Ijah. Studies on relative capabilities of bacterial and yeast isolates from tropical soil in degrading crude oil .Waste Management,1998,18:293-299.

[6]滕农, 徐虹, 欧阳平凯.油脂废水生物治理法.南京化工大学学报,1999, 21(3): 58-61.

[7]李清心, 康从宝, 王浩等.利用微生物处理石油废水的初步实验.工业水处理, 2003, 23(12): 13-15.

[8]卢显妍, 尹华, 张娜等.石油降解菌的筛选及其降解能力的研究.环境污染治理技术与设备, 2003, 4(12): 12-16.