Th17细胞相关细胞因子与急性移植物抗宿主病关系的探讨

凌艳英，周铭，王阿慧，江雪杰，李庆山*

（1.广州医科大学附属广州市第一人民医院a.检验科血液室，b.血液科广东广州510180；2.南方医科大学附属南方医院血液科广东广州510515）

Th17细胞相关细胞因子与急性移植物抗宿主病关系的探讨

凌艳英1，a，周铭1，b，王阿慧1，a，江雪杰2，李庆山*1，b

（1.广州医科大学附属广州市第一人民医院a.检验科血液室，b.血液科广东广州510180；2.南方医科大学附属南方医院血液科广东广州510515）

目的探讨异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病后，血清中Th17细胞相关的细胞因子与急性移植物抗宿主病的关系。方法78例血液病患者进行异基因造血干细胞移植，对移植后发生急性移植物抗宿主病患者（n=12），未发生急性移植物抗宿主病患者（n=14），及健康对照组（n=10），以及发生急性移植抗宿主病患者（n=10）在有效治疗前后，采用酶联免疫吸附法检测血清中细胞因子IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22浓度。结果①aGVHD者（n=12）血清中Th17细胞相关因子浓度（pg∕mL）较正常对照组（n=10）和无aGVHD组（n=14）显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而TGF-β1（1 156.61± 458.04）显著低于正常对照组（2 978.34±1 647.71）和无aGVHD组（2 541.62±1 805.16），差异有统计学意义（P＜0.05）。IL-22：未发生aGVHD组高于健康对照组（22.14±2.49，19.18±1.24），差异有统计学意义（P＜0.05）；除IL-21、IL-22和IL-23浓度高于健康对照组外（P＜0.05），其余的细胞因子健康对照组和无急性aGVHD组差异无统计学意义（P＞0.05），aGVHD组血清IL-22浓度与无aGVHD和健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。②10例有效治疗者，治疗后均有降低，治疗前后差异有统计学意义（P＜0.05），而IL-22在有效治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）。结论Th17细胞相关的细胞因子与（IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1）与aGVHD的发生发展和疗效有关，而与IL-22无关。

移植物抗宿主病；急性；细胞因子；Th17细胞；调节性T细胞

急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host diseae，aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）后的主要并发症，Allo-HSCT可望治愈肿瘤性或者非肿瘤性血液疾病，但是aGVHD可以引起移植患者早期死亡［1］。以往研究aGVHD的病理生理过程主要集中在Th1和IFN-γ作用介导aGVHD的发生，然而最近的研究报道显示，抑制Th1分化或者中和IFN-γ反而导致更加严重的aGVHD［2-3］，因此，Th1介导的aGVHD理论面临着挑战，应该还存在一类不同于Th1细胞的其他新型的Th细胞在aGVHD中发挥重要作用。虽然动物实验移植模型中经典的理论认为aGVHD是Th1细胞介导的，但是目前认为新型的产生特征性细胞因子IL-17A的T细胞亚群（Th17细胞）和调节性T细胞（Tregs）在aGVHD中发挥着重要作用。

研究发现肾、心实体器官移植，出现排斥与供体器官中Th1∕17细胞的富集有关，异源性抗原或者自身抗原产生的免疫反应的类型，与移植器官中Th17、Th1∕17或者Th22产生的细胞因子有关［4］，而目前对于Allo-HSCT后Th1、Th17细胞重建与移植排斥及aGVHD发生尚缺乏试验及临床研究。

因此Th1、Th2、Th17、Tregs间的精密平衡是移植后aGVHD的发生、严重程度和特定组织损害的重要因子，故笔者拟探讨血清中Th17细胞相关细胞因子与aGVHD的关系。

1 材料与方法

1.1 患者一般资料

研究患者来自2010年1月至2013年10月住院的78例各类血液病患者，其中男性45例，女性33例，中位年龄38（11～56）岁。重型再生障碍性贫血（SAA）为初治或者免疫抑制治疗无效者，骨髓增生异常综合征（MDS）为RAEB-2化疗后达到完全缓解（CR），余为RAEBT-1型或者RCMD型初治者，非何杰金氏淋巴瘤（NHL）或者多发性骨髓瘤（MM）为化疗达到部分缓解（PR）或者CR，慢性粒细胞白血病病—慢性期（CML-CP）和原发性骨髓纤维化为初治者，其余急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓细胞白血病（AML）均为第一个缓解期（CR1），诊断及疗效标准见文献［5］。HLA配型采用测序新技术PCR-SBT（sequencing based typing）或者PCR-SSP（sequence specific primer）方法，HLA-A、B、C、DR、DQ、DP位点高分辨配型。诊断与造血干细胞来源及配型情况见表1。造血干细胞来源为单纯骨髓、单纯外周血或者骨髓联合外周血。aGVHD：aGVHD的诊断及严重程度根据国际标准进行［6］。

1.2 治疗方法

预处理方案见表1。

表1 78例患者的预处理方案Tab.1Pretreatment regimen for 78 patients

1.2.1 aGVHD的预防同胞供者采用CSA联合短程MTX的方案：CSA（-3 d起）静脉滴注维持16h，3mg（∕kg·d），能够口服时改口服，移植后100 d内维持全血血药浓度200～400 μg∕L。MTX采用经典短程的方案：15 mg∕m2（+1 d、+3 d、+6 d），10 mg∕m（2+11 d）。

血缘关系半相合及非血缘关系移植采用上述方案，或者加上酶酚酸酯（骁悉）（mycophenolate mofetil，MMF）0.5 g bid（-1 d～+30 d）。

1.2.2 植入证据的检测性染色体、ABO血型、微卫星法DNA指纹图，按照以往的检测方法，选取微卫星DNA位点，采用降落法PCR（TDPCR）扩增，80 g∕L聚丙烯酰胺凝胶电泳［7］和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），供受者性别不同者采用FISH方法检测骨髓XX∕XY性染色体的比例。

1.2.3 ELISA法检测血清细胞因子抽取正常健康人及患者的外周血2mL，使用血清分离管，凝固至少30 min，然后1 000 g离心10 min。分离血清层保存在-80℃冰箱，检测时避免反复冻融。

血清中细胞因子IL-17A、IFN-γ、TGF-β、IL-21、IL-23、IL-22试剂盒（购自美国Biolegend公司），操作按照说明书进行。

1.3 统计学方法

所有计量资料采用均值加减标准差（xˉ±s）表示，两组间均值比较，先进行方差齐性F检验，若方差齐，采用独立样本t检验，方差不齐，改用t′检验；自身对照均值比较，采用配对t检验；多组间均值的比较，采用单因素方差分析，若方差齐采用F检验进行总体均值比较、SNK法进行均值两两比较，方差不齐时采用Welch检验进行总体均值比较、Dunnett T3法进行均值两两比较。均由SPSS16.0进行统计分析，α=0.05。

2 结果

采用ELISA法，对发生aGVHD患者的血清，进行了Th17细胞相关的细胞因子（IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22）检测，无aGVHD者和正常者作为对照组，结果发现（见表2，表3），除IL-22和IL-23无aGVHD组高于健康对照组外（P＜0.01），其余细胞因子无aGVHD组与健康对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；aGVHD组IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ浓度均高于健康对照组（P＜0.01）和无aGVHD组（P＜0.05）；aGVHD组与健康对照组和无aGVHD组比较，血清TGF-β1水平则明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。而IL-22在健康对照组、无aGVHD组和aGVHD组均呈低水平的分泌，虽然无aGVHD组的水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），但是aGVHD组与健康对照组和无aGVHD组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 急性aGVHD患者血清中Th17相关细胞因子的浓度Tab.2Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD（pg∕mL）（ˉ±s）

表2 急性aGVHD患者血清中Th17相关细胞因子的浓度Tab.2Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD（pg∕mL）（ˉ±s）

注：与健康对照组比较，①P＜0.05，（1）P＜0.01；与无aGVHD组比较，②P＜0.05，（2）P＜0.01。

组别健康对照无aGVHD aGVHD F∕Welch P n 10 14 12 IL-17 9.85±3.72 10.38±6.62 27.88±10.07⑴⑵22.928 0.000 IL-23 56.34±11.18 88.10±28.37⑴201.67±66.54⑴⑵36.816 0.000 IL-21 123.78±21.19 132.43±48.99⑴278.78±88.68⑴⑵24.438 0.000 IFN-γ 23.42±8.78 21.78±6.93 42.56±22.47①②7.792 0.002 TGF-β1 2 978.34±1 647.71 2 541.62±1 805.16 1156.61±458.04①②4.956 0.013 IL-22 19.18±1.24 22.14±2.49(1)20.15±1.85 76.957 0.003

表3 急性GVHD患者有效治疗前后Th17细胞相关因子浓度Tab.3Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD before and after effective treatment（pg∕mL）（ˉ±s）

表3 急性GVHD患者有效治疗前后Th17细胞相关因子浓度Tab.3Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD before and after effective treatment（pg∕mL）（ˉ±s）

注：与治疗前比较。①P＜0.05，（1）P＜0.01。

组别治疗前治疗后差值t P IL-17 11.85±3.81 6.48±1.89⑴5.372 00 3.403 0.008 IL-23 46.35±11.11 29.42±7.14⑴16.933 00 4.389 0.002 IL-21 280.20±66.86 148.78±49.28⑴141.417 00 5.034 0.001 IFN-γ 47.46±110.18 36.31±6.66①11.146 00 2.304 0.047 TGF-β1 183.52±29.86 223.32±29.86①39.796 00 3.234 0.010 IL-22 22.61±1.27 25.40±4.41 2.788 00 1.677 0.128

为进一步观察上述细胞因子和aGVHD的转归关系，笔者检查了10例aGVHD治疗有效者在治疗前后的细胞因子变化，结果发现（见表2，表3）：IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ细胞因子浓度有效治疗后显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。而TGF-β1明显回升，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-22血清浓度，在有效治疗前后均呈现低水平的分泌，治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

Th17细胞产生特征性的细胞因子：IL-17（IL-17A）、IL-17F、IL-21和IL-22，Th17细胞分化需要TGF-β和IL-6，维持Th17表型稳定需要IL-23、TNF和IL-1β，然而Th17的扩增主要依赖于IL-21。对于Th17在异基因造血干细胞移植时aGVHD发病中的作用，动物实验模型研究得出了不同的结论，一些资料认为Th17起到保护作用，而一些资料则认为其在aGVHD的发病中起到致病作用［8-10］。在人造血干细胞移植的回顾性研究中，也存在一些分歧，一些研究发现在外周血或者发生aGVHD的组织中Th17细胞增加［11-12］，而另外的研究则发现在损害靶器官中是减少的［13］。尽管在鼠模型中Th17细胞的作用得到了广泛研究，但是在患者进行异基因造血干细胞移植后，Th17细胞相关的细胞因子表达在aGVHD中的作用仍然值得研究。

由于Th17细胞与Th1和Tregs的发育相互制约和相互转化［14-15］，在Th1和Th17细胞共同促进aGVHD发生［16］，故本研究在进行Th17相关细胞因子检测的同时，也对Th1和Tregs相关的细胞因子也进行了检测，包括：IL-17、IL-21、IL-22、INF-γ和TGF-β1。结果发现，IL-17、IL-21和IL-23在发生aGVHD时显著高于未发生aGVHD组和正常对照组；而其中治疗有效的患者在治疗缓解后，上述细胞因子则显著下降，表明IL-17、IL-21在aGVHD发病中发挥作用，而IL-23在维持Th17功能中发挥作用，进一步促进了Th17在aGVHD中的致病作用。动物研究发现中和或者阻断T细胞的IL-21信号通路减少了aGVHD发生［17-18］，试验研究发现阻断IL-23信号通路，减轻了结肠aGVHD的发生，有效分离aGVHD和移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GVL）效应，IL-23可能作为治疗aGVHD的靶点［19-20］。最近采用的Ustekinumab（结合于IL-12和IL-23的p40亚单位）能够成功治疗糖皮质激素耐药的aGVHD［21］，均有力支持本研究中细胞因子动态观察结果。

在笔者的研究中，血清中Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ在发生aGVHD组均较无aGVHD组和正常对照组高，而有效治疗后则显著下降，表明了Th17和Th1细胞在aGVHD的发病中协同作用，YuY等［22］发现基因修饰T-bet和RORγt的小鼠Th1或者Th17细胞分化转录因子不能减轻aGVHD，同时敲除T-bet和RORγt基因则减轻了aGVHD的发病，进一步证明了Th1和Th17细胞的协同作用［23］。但是国内王静等［24］研究发现，aGVHD患者血浆标本中IFN-γ浓度高于正常对照组和无aGVHD组，在aGVHD有效治疗后血浆中浓度有降低但是差异无统计学意义，与本组结果不同，可能与本组为血清标本、aGVHD的严重程度可能不同、以及获取标本的时间可能有差异等有关。

在Th1和Th17细胞的失衡与aGVHD严重程度的关系研究中，Pan B等［16］在小鼠的模型中发现外周血中Th1∕Th17细胞比值的增高，aGVHD的程度加重，可能与Th1细胞在aGVHD发病中占据主导地位有关［23］，但是目前无临床相关报道。因而将aGVHD归于Th1或者Th17都是过于简单化，aGVHD的发病是Th1和Th17的协同作用，有待临床研究证实。在造血干细胞移植后，T细胞免疫重建中存在同时产生IL-17和IFN-γ的Th1∕17细胞，“Th1∕17”表型细胞有向Th1分化的可塑性，有助于Th1反应，在aGVHD发病中Th1细胞是主要作用，Th17细胞是次要作用，不排除Th17促进aGVHD的发生，不体现在其数量上的扩增，而是通过向Th1细胞的分化。

本研究发现，与IL-17的变化趋势相反，无aGVHD者血清IL-22水平略高于健康对照组，差异有统计学意义，但是无aGVHD者和aGVHD患者血清水平差异无统计学意义，有效治疗前后差异无统计学意义，均呈低水平分泌，IL-22主要在Th1和Th17中表达，最近的一项研究显示IL-22可以保护肠道干细胞免受炎症介导的组织损伤，从而减轻aGVHD的发生［25］，在小鼠的移植研究中发现，IL-22基因敲除的供者T细胞移植减轻了aGVHD，保留了GVL效应［26］，但其在aGVHD发病中的作用有待进一步研究。

（References）

［1］FERRARA J L，LEVINE J E，REDDY P，et al.Graft-versus-host disease［J］.Lancet，2009，373（9674）：1550-1561.

［2］CAVET J，DICKINSON A M，NORDEN J，et al.Interferon-gamma and interleukin-6 gene polymorphisms associate with graft-versus-host disease in HLA-matched sibling bone marrow transplantation［J］.Blood，2001，98（5）：1594-1600.

［3］BURMAN A C，BANOVIC T，KUNS R D，et al.IFNgamma differentially controls the development of idiopathic pneumonia syndrome and GVHD of the gastrointestinal trac［tJ］.Blood，2007，110（3）：1064-1072.

［4］SULLIVAN J A，ADAMS A B，BURLINGHAM W J.The emerging role of Th17 cells in organ transplantation［J］.Transplanta⁃tion，2014，97（5）：483-489.

［5］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.3版.北京：科学出版社，2007：106-200.

［6］PREZEPIORKA D，WEISDORF D，MARTIN P，et al.1994 consensus conference on acute GVHD grading［J］.Bone Mar⁃row Transplant，1995，15（6）：825-828.

［7］李庆山，毛平，王顺清，等.非清髓性移植后供者淋巴细胞输注治疗血液病的疗效观察［J］.中山大学学报：医学科学版，2004，25（6）：573-576，605.

［8］YI T，ZHAO D，LIN C L，et al.Absence of donor Th17 leads to augmented Th1 differentiation and exacerbated acute graft-versus-host disease［J］.Blood，2008，112（5）：2101-2110.

［9］KAPPEL L W，GOLDBERG G L，KING C G，et al.IL-17 contributes to CD4-mediated graft-versus-host disease［J］. Blood，2009，113：945-952.

［10］ICLOZAN C，YU Y，LIU C，et al.T helper 17 cells are sufficient but not necessary to induce acute graft-versus-host dis⁃ease［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2010，16（2）：170-178.

［11］DANDER E，BALDUZZI A，ZAPPA G，et al.Interleukin-17-producing T-helper cells as new potential player mediating graft-versus-host disease in patients undergoing allogeneic stem-cell transplantation［J］.Transplantation，2009，88（11）：1261-1272.

［12］WEAVER C T，HATTON R D，MANGAN P R，et al.IL-17 family cytokines and the expanding diversity of effector T cell lineages［J］.Annu Rev Immunol，2007，25：821-852.

［13］RATAJCZAK P，JANIN A，PEFFAULT DE LATOUR R，et al.Th17∕Treg ratio in human graft-versus host disease［J］. Blood，2010，116（7）：1165-1171.

［14］BASU R，HATTON R D，WEAVER C T.The Th17 family：flexibility follows function［J］.Immunol Rev，2013，252（1）：89-103.

［15］MURANSKI P，RESTIFO N P.Essentials of Th17 cell commitment and plasticity［J］.Blood，2013，121（13）：2402-2414.

［16］PAN B，ZENG L，CHENG H，et al.Altered balance between Th1 and Th17 cells in circulation is an indicator for the sever⁃ity of murine acute GVHD［J］.Immunol Lett，2012，142（1∕2）：48-54.

［17］BUCHER C，KOCH L，VOGTENHUBER C，et al.IL-21 blockade reduces graftversus-host disease mortality by support⁃ing inducible T regulatory cell generation［J］.Blood，2009，114（26）：5375-5384.

［18］HANASH A M，KAPPEL L W，YIM N L，et al.Abrogation of donor T-cell IL-21 signaling leads to tissue-specific modula⁃tion of immunity and separation of GVHD from GVL［J］.Blood，2011，118（2）：446-455.

［19］DAS R，KOMOROWSKI R，HESSNER M J，et al.Blockade of interleukin-23 signaling results in targeted protection of the colon and allows for separation of graft-versus-host and graft-versus-leukemia responses［J］.Blood，2010，115（25）：5249-5258.

［20］THOMPSON J S，CHU Y，GLASS J F，et al.Absence of IL-23p19 in donor allogeneic cells reduces mortality from acute GVHD［J］.Bone Marrow Transplantation，2009，45（4）：714-722.

［21］YI T，ZHAO D，LIN C L，et al.Absence of donor Th17 leads to augmented Th1 differentiation and exacerbated acute graft-versus-host disease［J］.Blood，2008，112（5）：2101-2110.

［22］YU Y，WANG D，LIU C，et al.Prevention of GVHD while sparing GVL by targeting Th1 and Th17 transcription factor T-bet and RORγt in mice［J］.Blood，2011，118（18）：5011-5020.

［23］TESHIMA T.Th1 and Th17 join forces for acute GVHD［J］.Blood，2011，118（18）：4765-4767.

［24］王静，王兴兵，汪健，等.GVHD患者外周血Th17∕Treg细胞相关的细胞因子检测与临床意义［J］.中国实验血液学杂志，2011，19（2）：422-426.

［25］HANASH A M，DUDAKOV J A，HUA G，et al.Interleukin-22 protects intestinal stem cells from immune-mediated tissue damage and regulates sensitivity to graft versus host disease［J］.Immunity，2012，37（2）：339-350.

［26］ZHAO K，ZHAO D，HUANG D，et al.The identification and characteristics of IL-22-producing T cells in acute graft-ver⁃sus-host disease following allogeneic bone marrow transplantation［J］.Immunobiology，2013，218（12）：1505-1513.

（责任编辑：陈旷）

Relationship of Cytokines Associated with Th17 Cells and Acute Graft-versus-host Disease

LING Yanying1，a，ZHOU Ming1，b，WANG Ahui1，a，JIANG Xuejie2，LI Qingshan*1，b
（1.a.Clinical Laboratory，b.Department of Hematology，Guangzhou First People′s Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，Guangdong，China；2.Department of Hematology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

ObjectiveTo explore the relationship of cytokones associated with Th17 cells in serum and acute graft-versus-host disease from patients with hematologic diseases who were undergone al⁃logeneic hematopoietic stem cell transplantation.MethodsIn this study，78 patients with haemato⁃logical diseases were undergone allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Th17 cell-associ⁃ated cytokines in serum were examined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）from pa⁃tients with acute graft-versus-host disease（aGVHD）（n=12），without aGVHD（n=14），and patientswith aGVHD who were effectively treated（n=10）.Healthy volunteers（n=10）were severed as control.Results①The serum cytokine levels（pg∕mL）of patients with aGVHD（n=12）were signifi⁃cantly higher compared with healthy control group（n=10）and non-aGVHD group（n=14）（P＜0.05）. On contrary，The TGF-β1 level（pg∕mL）（1 156.61±458.04）was significantly lower than the healthy control group（2 978.34±1 647.71）and non-aGVHD group（2 541.62±1 805.16）（P＜0.05）.IL-22：non-aGVHD group was significantly higher than healthy control group（22.14±2.49，19.18±1.24）（P＜0.05）；IL-21，IL-22，IL-23 were higher than healthy control group（P＜0.05），there was no statistical difference about other cytokines between healthy control group and non-aGVHD group（P＞0.05）.②After treatment，the cytokine levels above in 10 cases of effective treatment decreased to considerable extent，and there was significant difference between before and after effective treatment（P＜0.05），but the IL-22 showed no significant difference between before and after effective treatment（P＞0.05）.ConclusionTh17 cell-associated cytokines（IL-17，IL-23，IL-21，IFN-γ，TGF-β1）in serum are assocoated with pathogenesis，development and treat⁃ment efficacy of aGVHD，whereas acute GVHD is no relationship with IL-22 cencentration in serum.

graft-versus-host disease；acute；cytokine；Th17 cell；regulatory T cell

R593

A

1673-0143（2014）04-0063-06

2014-06-09

广东省自然科学基金资助项目（S2013010016726）

凌艳英（1977—），女，主管技师，研究方向：血液病形态学诊断。

*通讯作者：李庆山（1967—），男，主任医师，博士，研究方向：造血干细胞移植。E-mail：drliqingshang@126.com