老年2型糖尿病患者血清胆固醇酯脂肪酸检测

禹松林，周伟燕，杨睿悦，李红霞，张顺利，张天娇，赵海建，张传宝，王 抒，陈文祥，董 军

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科， 北京 1007302卫生部临床检验中心生化室， 北京 1007303卫生部北京医院老年医学研究所生化室， 北京 100730

·论 著·

老年2型糖尿病患者血清胆固醇酯脂肪酸检测

禹松林1，周伟燕2，杨睿悦3，李红霞3，张顺利2，张天娇2，赵海建2，张传宝2，王 抒3，陈文祥2，董 军3

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科， 北京 1007302卫生部临床检验中心生化室， 北京 1007303卫生部北京医院老年医学研究所生化室， 北京 100730

目的 探讨老年2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者血清胆固醇酯脂肪酸及相关生化指标变化情况。方法 研究纳入2012年8月至12月北京医院老年体检志愿者145例(年龄≥60岁)，包括确诊为2型DM患者(DM组)73例和健康对照者(对照组)72名，抽取空腹静脉血。用液相色谱串联质谱法测定血清11种主要胆固醇酯脂肪酸，计算各脂肪酸脱氢酶及脂肪酸碳链延长酶活性；同时用自动生化分析仪测定空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、载脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)、载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)、超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)等生化指标，用独立样本t检验、非参数检验、Logistic 回归等方法对数据进行分析。结果 DM组血清脂肪酸CE14∶0、CE16∶1和CE22∶6显著低于对照组(P<0.05)，其他脂肪酸成分差异不具有统计学意义；与对照组相比，DM组Δ9-脂肪酸脱氢酶(Δ9-desaturase)活性显著降低(P=0.001)；Logistic回归分析显示CE22∶6和Δ9-desaturase活性对预测DM患病风险具有统计学意义(P<0.05)；校正年龄、性别、体重指数(body mass index，BMI)、TC、TG、 FPG因素影响后，与CE22∶6最低四分位数(CE22∶6≤0.47%)相比，最高四分位数(CE22∶6>0.68%)患DM的比值比为0.27(95%CI: 0.08～0.86，Wald值4.93，P<0.05)；与Δ9-desaturase活性最低四分位数(Δ9-desaturase活性≤0.12)相比，最高四分位数(Δ9-desaturase活性>0.17)患DM的比值比为0.06(95%CI: 0.01～0.22，Wald值17.39，P<0.01)。CE14∶0和CE20∶3与FPG呈显著负相关(r=-0.18、-0.17，P<0.05)；CE18∶0与BMI、TG呈显著正相关(r=0.25、0.24，P<0.01)，而与HDL-C和ApoAI呈显著负相关(r=-0.39、-0.35，P<0.01)；CE20∶3与BMI的相关性最强(r=0.42，P<0.01)。结论 老年2型DM患者血清部分胆固醇酯脂肪酸降低，CE22∶6和Δ9-desaturase可能对2型DM具有保护作用，平衡脂肪酸摄入对防治2型DM具有重要意义。

脂肪酸；2型糖尿病；脂肪酸脱氢酶

MedJPUMCH,2014,5(3):264-269

随着中国老龄化进程的加速，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成为一项严重的公共卫生问题，Xu等[1]发表在JAMA上的文章显示中国成人DM患病率已上升至 11.6%。实施有效的早期预防干预措施对防治DM至关重要。其中，饮食脂肪性质与DM发生发展密切相关[2]，监测DM患者血清脂肪酸含量变化对指导健康饮食、防治DM具有重要意义。研究指出血清胆固醇酯脂肪酸可反映过去数周饮食脂肪性质，同时可反映摄食脂肪酸在脱氢酶和(或)碳链延长酶作用下的内源性转换，与胰岛素抵抗、糖耐量及2型DM相关[3- 4]。本研究通过比较2型DM患者和健康对照者血清中胆固醇酯脂肪酸含量的变化，同时分析血清脂肪酸与2型DM其他危险因素的关系，以期对指导健康饮食、防治糖尿病提供实验室依据。

对象和方法

对象

2012年8月至12月北京医院60岁以上老年体检人群中招募73例DM患者作为DM组，其中男46例，女27例，平均年龄(69±6)岁。入选DM患者均依据《2010中国2型糖尿病防治指南》为2型DM诊断标准，或者临床已诊断为2型DM。同时在60岁以上体检人群中选取年龄、性别相匹配的72名表观健康者作为对照组，其中男45名，女27名，平均年龄(69±7)岁，均无DM病史。入选人群无心血管、高血压等疾病，2个月内未食用深海鱼油等保健品。

仪器、试剂和血清样品

本研究使用的主要仪器为LC-MS/MS系统，由1200型高效液相色谱仪(Agilent，美国)和API 4000 Triple Quadruple质谱仪(AB SCIEX，美国)组成；其他仪器包括MicroLab 500稀释器(Hamilton，美国)、XL- 90超速离心机(Beckman Coulter，美国)和7180自动生化分析仪(日立，日本)等。

脂肪酸测定中作参考标准的胆固醇酯脂肪酸购自美国Nuchek Prep. Inc公司。色谱纯乙腈、正己烷和异丙醇购自美国Fisher Scientific公司，甲酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司，总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、载脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)、载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)等试剂盒为日本Sekisui Medical Technologies公司产品。空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)和超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)等试剂盒为罗氏(Roche)公司产品。

血清胆固醇酯脂肪酸测定

血清胆固醇酯脂肪酸测定采用本实验室建立的LC-MS/MS法[5]，首先用异丙醇沉淀血清蛋白，之后将提取物进行液质分析，液相色谱采用Nova-Pak C18色谱柱(4 μm, 2.1 mm×150 mm)，流动相为95% A相(异丙醇∶乙腈∶正己烷=55∶45∶15)和5% B相(含100 mmol/L甲酸铵的甲醇溶液)，流速为0.3 ml/min，柱温30 ℃，进样1 μl。质谱采用电喷雾离子源正离子下多离子反应监测模式，以归一化法进行定量，共测定血清中11种主要胆固醇酯，包括CE14∶0、CE16∶0、CE16∶1、CE18∶0、CE18∶1、CE18∶2、CE18∶3、CE20∶3、CE20∶4、CE20∶5、CE22∶6。饱和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)=CE14∶0+CE16∶0+CE18∶0，单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFA)=CE16∶1+CE18∶1，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)=CE18∶2+CE18∶3+CE20∶3+CE20∶4+CE20∶5+CE22∶6。

生化指标测定

TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB、FPG和hsCRP用7180自动生化分析仪使用试剂盒进行测定。

脂肪酸相关酶活性测定

根据产物与其对应的前体比率计算得出，Δ9-脂肪酸脱氢酶(Δ9-desaturase)活性=CE16∶1/CE16∶0，Δ6-脂肪酸脱氢酶(Δ6-desaturase)活性=CE18∶3/CE18∶2，Δ5-脂肪酸脱氢酶(Δ5-desaturase)活性=CE20∶4/CE20∶3，碳链延长酶(elongase)活性=CE20∶3/CE18∶3。

统计学处理

用SSPS 17.0统计软件进行统计分析。正态分布样本比较采用两独立样本t检验分析，非正态分布两独立样本比较选用非参数检验(Mann-WhitneyU)，对有统计学意义的定量变量按四分位数分为四组，建立模型，用二元Logistic回归和Wald检验分析其与DM的相关性，用双变量偏相关分析(Spearman相关分析)研究血清脂肪酸和其他生化指标的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

DM组和对照组基本特征

DM组和对照组患者的年龄、体重指数(body mass index，BMI)、 FPG、血脂指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB)、hsCRP见表1。其中，DM组和对照组BMI、FPG、TC、LDL-C、TG、ApoB、hsCRP之间差异有统计学意义(P<0.05)。

DM组和对照组脂肪酸含量比较

本研究145例检测对象血清脂肪酸含量多呈非正态分布，因此选用两独立样本的非参数检验(Mann-WhitneyU)比较DM组和对照组脂肪酸含量。结果显示DM组血清CE14∶0、CE16∶1、CE22∶6以及Δ9-desaturase活性显著低于对照组(P<0.05)，其他各脂肪酸及总SFA、MUFA、PUFA等差异无统计学意义(表2)。

表 1 DM组和对照组人群基本特征±s)

DM：糖尿病；BMI：体重指数；FPG：空腹血糖；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；TG：甘油三酯；ApoAI：载脂蛋白AI；ApoB：载脂蛋白B；hsCRP：超敏C反应蛋白

进一步用Logistic回归和Wald检验分析CE14∶0、CE16∶1、CE22∶6含量以及Δ9-desaturase活性，首先作为定量自变量直接带入模型评估这4种指标不同水平时2型DM的患病风险，结果显示CE22∶6和Δ9-desaturase活性对预测2型DM患病风险具有统计学意义(Wald值=8.41,4.97；P<0.01, 0.05)。然后结合实际意义，将CE22∶6浓度及Δ9-desaturase活性根据四分位数分为4组，建立校正性别、年龄因素下的模型1，进一步行Logistic回归和Wald检验分析，结果显示：CE22∶6与最低四分位数(CE22∶6≤0.47%)相比，最高四分位数(CE22∶6>0.68%)患DM的比值比(odds ratio，OR)为0.27(95%CI：0.09～0.77，Wald值=5.95，P<0.05)；Δ9-desaturase活性与最低四分位数(Δ9-desaturase活性≤0.12)相比，第三(0.14%<Δ9-desaturase活性≤0.17)和最高四分位数(Δ9-desaturase活性>0.17)患DM的OR分别为：0.24(95%CI:0.08～0.70，Wald值=6.81，P<0.01)和0.15(95%CI:0.05～0.44，Wald值=11.82，P<0.01)，CE22∶6和Δ9-desaturase均表现出对DM的保护作用。进一步校正 BMI、FPG、TC、TG后建立模型2进行Logistic回归分析及Wald检验，趋势更加显著，并且与最低四分位数相比，CE22∶6的第三和最高四分位数以及Δ9-desaturase活性第二、第三和最高四分位数差异均有统计学意义，且Δ9-desaturase活性随着四分位数增大患DM的OR值变小(表3)，由此可见CE22∶6含量或Δ9-desaturase活性高对2型DM可能具有保护作用。

表 2 DM组和对照组脂肪酸含量比较[M(Q1～Q3)]

DM：同表1；CE：胆固醇酯；SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸；desaturase：脂肪酸脱氢酶；elongase：碳链延长酶

表 3 CE22∶6和Δ9-desaturase水平与DM的相关关系

血清胆固醇酯脂肪酸含量与其他生化指标相关性分析

由于样本中脂肪酸呈非正态分布，因此采用Spearman偏相关分析血清胆固醇酯脂肪酸含量与其他生化指标的关系，结果显示，CE14∶0和CE20∶3与FPG呈显著负相关(r=-0.18，-0.17，P均<0.05)；饱和脂肪酸CE18∶0与BMI、TG、ApoB呈显著正相关(r=0.25，0.24，0.17，P均<0.05)而与HDL-C、ApoAI呈显著负相关(r=-0.39，-0.35，P均<0.01)；CE20∶3与BMI的相关性最强(r=0.42，P<0.01)；Δ6- desaturase活性与BMI呈显著正相关(r=0.29，P<0.01)，而Δ5- desaturase活性与BMI和TG均呈显著负相关(r=-0.33,-0.23，P均<0.01) (表4)。

讨 论

本研究中，CE14∶0、CE16∶1和CE22∶6三种脂肪酸以及Δ9-desaturase活性在老年2型DM患者中显著降低，进一步Logistic回归分析显示，CE22∶6和Δ9-desaturase可能对预防2型DM的发生具有积极作用。CE14∶0和CE16∶1可在人体内合成，不是人体必需脂肪酸，因此其含量多少不能真实反映摄入的水平，与DM的发生可能无直接关系，因此在进行Logistic回归分析后未表现出统计学意义。CE22∶6属于Omega- 3脂肪酸中的一种，其在体内不能合成，仅可从外源Omega- 3脂肪酸补充剂及深海鱼类获取，体内含量可反映摄食脂肪酸性质。大量的研究显示Omega- 3脂肪酸可以保护DM心血管、降低2型DM的发生风险[6- 8]，本研究中CE22∶6与2型DM的关系与文献报道结论一致。SFA、MUFA以及PUFA等未显示出与2型DM有关。Van Woudenbergh等[3]指出Δ9-desaturase活性降低可能是SFA与2型DM呈正相关的机制。在本研究中，虽未观察到总SFA有明显变化，但是Δ9-desaturase活性显著降低，为Van Woudenbergh提出的2型DM患者SFA向MUFA转换可能降低提供了很好的证据，且本研究显示，在校正年龄、性别、BMI、TC、TG、FPG因素之后，Δ9-desaturase活性的第二、第三、最高四分位数与最低四分位数相比，OR值分别为0.30(95%CI:0.09～0.95)、0.09(95%CI: 0.02～0.33)、0.06(95%CI: 0.01～0.22)。以上结果表明，老年2型DM患者具有较低的Δ9-desaturase活性，Δ9-desaturase活性可能是2型DM发病风险的预测因子。

此外，相关性分析显示饱和脂肪酸CE18∶0与BMI、TG、ApoB等心血管危险因素呈显著正相关，而与心血管保护因素HDL-C、ApoAI呈显著负相关，与文献报道的饱和脂肪酸是心血管疾病发生的危险因素相一致[9]。CE20∶3与BMI和TG呈显著正相关，但是与FPG呈显著负相关。CE20∶3属于Omega- 6脂肪酸，研究显示Omega- 6脂肪酸与心血管疾病关系不一致，多认为其可降低胰岛素抵抗，降低患糖尿病的风险[10- 11]。

表 4 各脂肪酸与其他生化指标的相关系数

BMI、FPG、TC、HDL-C、LDL-C、TG、ApoAI、ApoB、hsCRP：同表1； CE、SFA、MUFA、PUFA、desaturase、elongase：同表2；*P<0.05,**P<0.01

综上所述，老年2型DM患者血清中部分胆固醇酯脂肪酸显著降低，CE22∶6和Δ9-desaturase可能对老年2型DM具有保护作用，血清脂肪酸种类与BMI相关，平衡各脂肪酸摄入对防治2型DM具有重要意义。

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Detection of Serum Cholesterol Ester Fatty Acids in the Elderly with Type 2 Diabetes Mellitus

YU Song-lin1, ZHOU Wei-yan2, YANG Rui-yue3, LI Hong-xia3, ZHANG Shun-li2, ZHANG Tian-jiao2,ZHAO Hai-jian2, ZHANG Chuan-bao2, WANG Shu3, CHEN Wen-xiang2, DONG Jun3

1Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China2Department of Biochemistry, National Center for Clinical Laboratories, Ministry of Health, Beijing 100730, China3Key Laboratory of Geriatrics, Institute of Geriatrics, Ministry of Health, Beijing 100730, China

DONG Jun Tel: 010-85138520, E-mail:jun_dong@263.net

Objective To evaluate the alteration of cholesterol ester fatty acids and related serum biochemical

parameters in elderly patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM). Methods Totally 73 T2DM patients(T2DM group) and 72 healthy subjects(control group) (aged ≥60 years) who

health check-ups in Beijing Hospital from August to December in 2012 were recruited and blood samples were collected. Eleven main cholesterol ester fatty acids in serum were determined with liquid chromatography tandem mass spectrometry, and endogenous conversions by desaturases and elongases were estimated from product-to-precursor ratios. Fasting plasma glucose(FPG), total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C), apolipoprotein(Apo) AI(ApoAI), ApoB, and high sensitivity C-reactive protein(hsCRP) were analyzed with an automatic biochemistry analyzer and the results were statistically analyzed. Results CE14∶0, CE16∶1 and CE22∶6 in T2DM group were significantly lower than those in the control group(P<0.05), while no significant difference existed between other fatty acid compositions. Δ9-desaturase activity was lower in T2DM group compared with that in control group(P=0.001). After adjusting for age, gender, body mass index(BMI), TC, TG, and FPG，Logistic analysis showed the quartiles of CE22∶6 and Δ9-desaturase activity were associated with risk of type 2 DM, and the odds ratios were 0.27(95%CI: 0.08-0.86, Wald: 4.93,P<0.05)and 0.06(95%CI: 0.01-0.22, Wald:17.39,P<0.01), respectively, for comparison of the top to bottom quartile. Both CE14∶0 and CE20∶3 negatively correlated with FPG(r=-0.18,-0.17,P<0.05); CE18∶0 positively correlated with BMI and TG(r= 0.25, 0.24,P<0.01) and negatively correlated with HDL-C and ApoAI(r=-0.39,-0.35,P<0.01); CE20∶3 positively correlated with BMI, with a correlation coefficient of 0.42(P<0.01). Conclusions Several cholesterol ester fatty acids decrease in elderly T2DM patients. CE22∶6 and Δ9-desaturase may protect against T2DM. An appropriately balanced intake of fatty acids is helpful for the prevention of T2DM in the elderly population.

fatty acids; type 2 diabetes mellitus; desaturase

国家自然科学基金(81171647和81201337)

董 军 电话：010-85138520，E-mail：jun_dong@263.net

R446

A

1674-9081(2014)03-0264-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.004

2014- 04- 30)