食品微生物的检测能力验证

舒鹃娟等

能力验证（proficiency testing）即利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。通过能力验证能够评定实验室从事特定检测或测量的能力，识别实验室存在的问题并启动改进措施，提高实验室的检测能力等。因此，参加能力验证活动对实验室质量控制有着非常重要的意义。上海市闸北区疾病预防控制中心实验室已连续多年参加辽宁出入境检验检疫局食品微生物能力验证计划，现将从中收获的一些经验教训介绍如下，供同行参考。

1.2.2操作步骤

① 按照PTC-T028参试指导书的要求进行样品水化。从冰箱取出待测样品，待其恢复至室温后，无菌开启装有样品的西林瓶，立即加入4 mL生理盐水进行再水化，稀释液合计40 mL，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，全过程20 min内完成。将上述制备的40 mL待测原液按照标准方法进行后续操作。

② 菌落总数检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL灭菌生理盐水混匀，制成10-1稀释液，取10-1稀释液1 mL加9 mL灭菌生理盐水混匀，制成10-2稀释液，以此类推稀释至10-4。每稀释1次，换1次无菌吸管。每个稀释度样液各取1 mL加入到2个无菌平皿中，同时做空白对照。及时用15 mL冷却至45℃左右的平板计数琼脂倾注平皿，摇匀，待培养基凝固后倒置放入培养箱中，36℃培养48 h后进行菌落计数。

③ 大肠菌群检测。采用最可能数（most probable number，MPN）法进行大肠菌群计数。将经水化的待测样品按照菌落总数检测的方法制备10-1～10-6的稀释液。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1 mL，36℃培养48 h后，产气者进行复发酵试验，接种BGLB肉汤管36℃培养48 h后产气者计为大肠菌群阳性，记录每个稀释度的BGLB产气管数。

④ 金葡菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉汤制成混悬液，于36℃培养20 h，转种血平板和Baird-Parker平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑤ 沙门菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL BPW制成混悬液，于36℃培养18 h后，分别取1 mL转种TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培养24 h，SC置36℃培养24 h，分别转种BS平板内于36℃培养48 h及沙门菌属显色平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑥ 单增检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL LB1制成混悬液，于30℃培养24 h后，吸取0.1 mL转种于10 mL LB2中，置30℃培养24 h，转种于PALCAM平板和李斯特菌显色平板，36℃培养48 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑦ 志贺菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL志贺菌增菌液制成混悬液，于41.5℃厌氧培养20 h后转种XLD及MAC平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑧ 副溶血性弧菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL APW制成混悬液，于36℃培养16 h，转种TCBS及弧菌显色平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

3讨论

本实验室参加的7项能力验证试验反馈结果均为满意（《食品中微生物学能力验证计划PTC-T028结果报告》），表明本实验室能很好地应用国家标准（GB 4789，现行有效系列）开展相关项目的检测。本次能力验证的定量项目中，菌落总数和大肠菌群的满意率分别为90.5%和89.7%；定性项目中金葡菌满意率最高，78个结果反馈仅1个为不满意，满意率为98.7%；副溶血性弧菌满意率最低，56个结果反馈中，49个为满意，满意率为87.5%。此外，组织方将每一个项目分成不同组别，本实验室副溶血性弧菌项目被分配到指定值为阳性组，有26个结果反馈，只有20个为满意，满意率为76.9%。

在参加能力验证活动时，需要注意以下几方面：

实验前要仔细阅读参试指导书，按照其要求对样品进行前处理。对于定量项目来说，西林瓶中的样品是一个不可分割的整体，应全部溶解用于检测，不能只取一部分进行检测而造成结果不准确。样品打开后应立即水化，否则会导致样品吸潮溶解困难，影响准确计数。在样品稀释过程中要充分混匀，以免影响计数结果的准确性。采用倾注法对样品计数的项目，在倾注培养基后应摇动平板以保证细菌均匀分布，以免造成蔓延生长影响计数结果。由于MPN法是基于泊松分布的一种间接计数方法，其计数原理是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现细菌生长繁殖，然后根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最可能数”理论，查MPN表计算得出样品单位体积中细菌数的近似值。所以采用MPN法对样品计数的项目在操作时应稀释足够的倍数，以达到出现生长的最高稀释度，并谨慎选择计数的稀释度，即选择的3个稀释度既要包括所有重复都有菌液生长的最高稀释度，又要包括出现生长的最高稀释度，否则会影响MPN法的计数结果。

对于定性项目来说，保证培养基的质量，选择适合的培养基，检测人员的操作水平和经验判断都非常重要。每批次培养基应做好质控，并在有效期内使用。在首次分离培养时，建议使用弱选择性培养基，这是因为冷冻干燥过程可能造成细胞内核酸的损伤而诱导突变体的产生，可能导致目标菌在强选择性培养基上也无法生长。建议使用显色培养基，更方便有效地将目标菌和杂菌区分开来。在划线分离时，要尽可能多的分出单个菌落。能准确识别选择性平板上的可疑菌落，进行后续鉴定时，应挑取尽可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落数量太少没有取到目标菌而造成假阴性。认真完成所有的鉴别试验再做出判断，以免因判断依据不足而影响检测结果。在实验过程中，应设置阴、阳性对照，避免假阴性或假阳性结果出现而影响结果判断。

综上所述，能力验证是证明实验室检测能力的一种科学有效的技术手段，是对实验室检测技术能力和管理状况进行考核的客观方法，是实验室质量控制的重要手段，对实验室资质认定工作有效性的后续监督有着非常重要的作用。实验室能力验证试验结果的准确性，与实验室的工作技术水平直接相关。参加能力验证计划获得满意结果，能增强客户及相关方对实验室出具可靠数据的信心。通过能力验证活动，实验室能了解自身不足，有利于督促其加强自身能力建设，提高实验室人员检测技术水平，增加检测结果的正确性和可靠性。

4参考文献

[1]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则＼[S＼].2010.

[2]食品卫生微生物学检验大肠菌群计数. GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孙慧，李天添.大肠菌群MPN计数法与CFU计数法相关性初探＼[J＼].酿酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黄瑶，崔邦炳，黄翠姬，等.利用真空冷冻干燥法保藏几种常见细菌的研究＼[J＼].广西工学院学报，2006，17（2）：20-22.

能力验证（proficiency testing）即利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。通过能力验证能够评定实验室从事特定检测或测量的能力，识别实验室存在的问题并启动改进措施，提高实验室的检测能力等。因此，参加能力验证活动对实验室质量控制有着非常重要的意义。上海市闸北区疾病预防控制中心实验室已连续多年参加辽宁出入境检验检疫局食品微生物能力验证计划，现将从中收获的一些经验教训介绍如下，供同行参考。

1.2.2操作步骤

① 按照PTC-T028参试指导书的要求进行样品水化。从冰箱取出待测样品，待其恢复至室温后，无菌开启装有样品的西林瓶，立即加入4 mL生理盐水进行再水化，稀释液合计40 mL，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，全过程20 min内完成。将上述制备的40 mL待测原液按照标准方法进行后续操作。

② 菌落总数检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL灭菌生理盐水混匀，制成10-1稀释液，取10-1稀释液1 mL加9 mL灭菌生理盐水混匀，制成10-2稀释液，以此类推稀释至10-4。每稀释1次，换1次无菌吸管。每个稀释度样液各取1 mL加入到2个无菌平皿中，同时做空白对照。及时用15 mL冷却至45℃左右的平板计数琼脂倾注平皿，摇匀，待培养基凝固后倒置放入培养箱中，36℃培养48 h后进行菌落计数。

③ 大肠菌群检测。采用最可能数（most probable number，MPN）法进行大肠菌群计数。将经水化的待测样品按照菌落总数检测的方法制备10-1～10-6的稀释液。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1 mL，36℃培养48 h后，产气者进行复发酵试验，接种BGLB肉汤管36℃培养48 h后产气者计为大肠菌群阳性，记录每个稀释度的BGLB产气管数。

④ 金葡菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉汤制成混悬液，于36℃培养20 h，转种血平板和Baird-Parker平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑤ 沙门菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL BPW制成混悬液，于36℃培养18 h后，分别取1 mL转种TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培养24 h，SC置36℃培养24 h，分别转种BS平板内于36℃培养48 h及沙门菌属显色平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑥ 单增检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL LB1制成混悬液，于30℃培养24 h后，吸取0.1 mL转种于10 mL LB2中，置30℃培养24 h，转种于PALCAM平板和李斯特菌显色平板，36℃培养48 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑦ 志贺菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL志贺菌增菌液制成混悬液，于41.5℃厌氧培养20 h后转种XLD及MAC平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑧ 副溶血性弧菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL APW制成混悬液，于36℃培养16 h，转种TCBS及弧菌显色平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

3讨论

本实验室参加的7项能力验证试验反馈结果均为满意（《食品中微生物学能力验证计划PTC-T028结果报告》），表明本实验室能很好地应用国家标准（GB 4789，现行有效系列）开展相关项目的检测。本次能力验证的定量项目中，菌落总数和大肠菌群的满意率分别为90.5%和89.7%；定性项目中金葡菌满意率最高，78个结果反馈仅1个为不满意，满意率为98.7%；副溶血性弧菌满意率最低，56个结果反馈中，49个为满意，满意率为87.5%。此外，组织方将每一个项目分成不同组别，本实验室副溶血性弧菌项目被分配到指定值为阳性组，有26个结果反馈，只有20个为满意，满意率为76.9%。

在参加能力验证活动时，需要注意以下几方面：

实验前要仔细阅读参试指导书，按照其要求对样品进行前处理。对于定量项目来说，西林瓶中的样品是一个不可分割的整体，应全部溶解用于检测，不能只取一部分进行检测而造成结果不准确。样品打开后应立即水化，否则会导致样品吸潮溶解困难，影响准确计数。在样品稀释过程中要充分混匀，以免影响计数结果的准确性。采用倾注法对样品计数的项目，在倾注培养基后应摇动平板以保证细菌均匀分布，以免造成蔓延生长影响计数结果。由于MPN法是基于泊松分布的一种间接计数方法，其计数原理是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现细菌生长繁殖，然后根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最可能数”理论，查MPN表计算得出样品单位体积中细菌数的近似值。所以采用MPN法对样品计数的项目在操作时应稀释足够的倍数，以达到出现生长的最高稀释度，并谨慎选择计数的稀释度，即选择的3个稀释度既要包括所有重复都有菌液生长的最高稀释度，又要包括出现生长的最高稀释度，否则会影响MPN法的计数结果。

对于定性项目来说，保证培养基的质量，选择适合的培养基，检测人员的操作水平和经验判断都非常重要。每批次培养基应做好质控，并在有效期内使用。在首次分离培养时，建议使用弱选择性培养基，这是因为冷冻干燥过程可能造成细胞内核酸的损伤而诱导突变体的产生，可能导致目标菌在强选择性培养基上也无法生长。建议使用显色培养基，更方便有效地将目标菌和杂菌区分开来。在划线分离时，要尽可能多的分出单个菌落。能准确识别选择性平板上的可疑菌落，进行后续鉴定时，应挑取尽可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落数量太少没有取到目标菌而造成假阴性。认真完成所有的鉴别试验再做出判断，以免因判断依据不足而影响检测结果。在实验过程中，应设置阴、阳性对照，避免假阴性或假阳性结果出现而影响结果判断。

综上所述，能力验证是证明实验室检测能力的一种科学有效的技术手段，是对实验室检测技术能力和管理状况进行考核的客观方法，是实验室质量控制的重要手段，对实验室资质认定工作有效性的后续监督有着非常重要的作用。实验室能力验证试验结果的准确性，与实验室的工作技术水平直接相关。参加能力验证计划获得满意结果，能增强客户及相关方对实验室出具可靠数据的信心。通过能力验证活动，实验室能了解自身不足，有利于督促其加强自身能力建设，提高实验室人员检测技术水平，增加检测结果的正确性和可靠性。

4参考文献

[1]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则＼[S＼].2010.

[2]食品卫生微生物学检验大肠菌群计数. GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孙慧，李天添.大肠菌群MPN计数法与CFU计数法相关性初探＼[J＼].酿酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黄瑶，崔邦炳，黄翠姬，等.利用真空冷冻干燥法保藏几种常见细菌的研究＼[J＼].广西工学院学报，2006，17（2）：20-22.

能力验证（proficiency testing）即利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。通过能力验证能够评定实验室从事特定检测或测量的能力，识别实验室存在的问题并启动改进措施，提高实验室的检测能力等。因此，参加能力验证活动对实验室质量控制有着非常重要的意义。上海市闸北区疾病预防控制中心实验室已连续多年参加辽宁出入境检验检疫局食品微生物能力验证计划，现将从中收获的一些经验教训介绍如下，供同行参考。

1.2.2操作步骤

① 按照PTC-T028参试指导书的要求进行样品水化。从冰箱取出待测样品，待其恢复至室温后，无菌开启装有样品的西林瓶，立即加入4 mL生理盐水进行再水化，稀释液合计40 mL，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，全过程20 min内完成。将上述制备的40 mL待测原液按照标准方法进行后续操作。

② 菌落总数检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL灭菌生理盐水混匀，制成10-1稀释液，取10-1稀释液1 mL加9 mL灭菌生理盐水混匀，制成10-2稀释液，以此类推稀释至10-4。每稀释1次，换1次无菌吸管。每个稀释度样液各取1 mL加入到2个无菌平皿中，同时做空白对照。及时用15 mL冷却至45℃左右的平板计数琼脂倾注平皿，摇匀，待培养基凝固后倒置放入培养箱中，36℃培养48 h后进行菌落计数。

③ 大肠菌群检测。采用最可能数（most probable number，MPN）法进行大肠菌群计数。将经水化的待测样品按照菌落总数检测的方法制备10-1～10-6的稀释液。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1 mL，36℃培养48 h后，产气者进行复发酵试验，接种BGLB肉汤管36℃培养48 h后产气者计为大肠菌群阳性，记录每个稀释度的BGLB产气管数。

④ 金葡菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉汤制成混悬液，于36℃培养20 h，转种血平板和Baird-Parker平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑤ 沙门菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL BPW制成混悬液，于36℃培养18 h后，分别取1 mL转种TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培养24 h，SC置36℃培养24 h，分别转种BS平板内于36℃培养48 h及沙门菌属显色平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑥ 单增检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL LB1制成混悬液，于30℃培养24 h后，吸取0.1 mL转种于10 mL LB2中，置30℃培养24 h，转种于PALCAM平板和李斯特菌显色平板，36℃培养48 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑦ 志贺菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL志贺菌增菌液制成混悬液，于41.5℃厌氧培养20 h后转种XLD及MAC平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

⑧ 副溶血性弧菌检测。取经水化制备的待测原液25 mL，加入225 mL APW制成混悬液，于36℃培养16 h，转种TCBS及弧菌显色平板，于36℃培养24 h，挑取可疑菌落进行鉴定。

3讨论

本实验室参加的7项能力验证试验反馈结果均为满意（《食品中微生物学能力验证计划PTC-T028结果报告》），表明本实验室能很好地应用国家标准（GB 4789，现行有效系列）开展相关项目的检测。本次能力验证的定量项目中，菌落总数和大肠菌群的满意率分别为90.5%和89.7%；定性项目中金葡菌满意率最高，78个结果反馈仅1个为不满意，满意率为98.7%；副溶血性弧菌满意率最低，56个结果反馈中，49个为满意，满意率为87.5%。此外，组织方将每一个项目分成不同组别，本实验室副溶血性弧菌项目被分配到指定值为阳性组，有26个结果反馈，只有20个为满意，满意率为76.9%。

在参加能力验证活动时，需要注意以下几方面：

实验前要仔细阅读参试指导书，按照其要求对样品进行前处理。对于定量项目来说，西林瓶中的样品是一个不可分割的整体，应全部溶解用于检测，不能只取一部分进行检测而造成结果不准确。样品打开后应立即水化，否则会导致样品吸潮溶解困难，影响准确计数。在样品稀释过程中要充分混匀，以免影响计数结果的准确性。采用倾注法对样品计数的项目，在倾注培养基后应摇动平板以保证细菌均匀分布，以免造成蔓延生长影响计数结果。由于MPN法是基于泊松分布的一种间接计数方法，其计数原理是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现细菌生长繁殖，然后根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最可能数”理论，查MPN表计算得出样品单位体积中细菌数的近似值。所以采用MPN法对样品计数的项目在操作时应稀释足够的倍数，以达到出现生长的最高稀释度，并谨慎选择计数的稀释度，即选择的3个稀释度既要包括所有重复都有菌液生长的最高稀释度，又要包括出现生长的最高稀释度，否则会影响MPN法的计数结果。

对于定性项目来说，保证培养基的质量，选择适合的培养基，检测人员的操作水平和经验判断都非常重要。每批次培养基应做好质控，并在有效期内使用。在首次分离培养时，建议使用弱选择性培养基，这是因为冷冻干燥过程可能造成细胞内核酸的损伤而诱导突变体的产生，可能导致目标菌在强选择性培养基上也无法生长。建议使用显色培养基，更方便有效地将目标菌和杂菌区分开来。在划线分离时，要尽可能多的分出单个菌落。能准确识别选择性平板上的可疑菌落，进行后续鉴定时，应挑取尽可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落数量太少没有取到目标菌而造成假阴性。认真完成所有的鉴别试验再做出判断，以免因判断依据不足而影响检测结果。在实验过程中，应设置阴、阳性对照，避免假阴性或假阳性结果出现而影响结果判断。

综上所述，能力验证是证明实验室检测能力的一种科学有效的技术手段，是对实验室检测技术能力和管理状况进行考核的客观方法，是实验室质量控制的重要手段，对实验室资质认定工作有效性的后续监督有着非常重要的作用。实验室能力验证试验结果的准确性，与实验室的工作技术水平直接相关。参加能力验证计划获得满意结果，能增强客户及相关方对实验室出具可靠数据的信心。通过能力验证活动，实验室能了解自身不足，有利于督促其加强自身能力建设，提高实验室人员检测技术水平，增加检测结果的正确性和可靠性。

4参考文献

[1]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则＼[S＼].2010.

[2]食品卫生微生物学检验大肠菌群计数. GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孙慧，李天添.大肠菌群MPN计数法与CFU计数法相关性初探＼[J＼].酿酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黄瑶，崔邦炳，黄翠姬，等.利用真空冷冻干燥法保藏几种常见细菌的研究＼[J＼].广西工学院学报，2006，17（2）：20-22.