促红细胞生成素和血管紧张素受体拮抗剂对脑缺血再灌注后梗死体积和脑组织水肿的影响

刘慧丽，梁丽贞，吴春丽

促红细胞生成素和血管紧张素受体拮抗剂对脑缺血再灌注后梗死体积和脑组织水肿的影响

刘慧丽，梁丽贞，吴春丽

目的 研究促红细胞生成素(EPO)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)对脑缺血后的脑保护作用。方法 采用健康的SD大鼠，线栓法阻断一侧大脑中动脉血流2 h，再灌注24 h，建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)，治疗组分别予缺血再灌注前后经腹腔注射EPO 3 000 IU/(kg·d)，或缬沙坦40 mg/(kg·d)，评价大鼠神经功能，测定其脑梗死体积占全脑体积的百分比、脑组织的含水量。结果 与缺血再灌注组相比，EPD处理组可改善神经功能缺失，减少脑梗死体积，降低梗死组织含水量，且经EPD预处理，改善更明显，差异有统计学意义(P<0.05)；与缺血再灌注组相比，ARB处理组可减少脑梗死体积，降低梗死组织含水量，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EPD和ARB可减少脑梗死体积，降低梗死组织含水量，EPD可明显改善神经功能缺失，经EPD和ARB预处理改善更为明显，具有良好的脑保护作用。

促红细胞生成素；ARB；脑缺血

0 引言

卒中是引起人类死亡的前三位原因，且生存的病人中至少有一半留有不同程度的残疾，因此，卒中也成为最重要的严重致残疾病。目前认为，迅速溶栓复流是脑梗死急性期治疗成功的前提和基础，而确实的脑保护则是治疗成功的基本保证，两个环节相互相成，缺一不可。研究和开发脑保护剂是当前的热点，促红细胞生成素(EPO)和血管紧张素受体拮抗剂(Angiotensin receptor blocker,ARB)在中枢神经系统疾病中的脑保护作用正日益受到关注[1-2]。本论文拟研究EPO和ARB对大鼠脑缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，IR)损伤后神经神经功能缺失、脑水肿、脑梗死体积的影响，以探讨EPO和ARB的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠70只，雌雄各半，体重270～320 g，由浙江医学科学研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 首先SD大鼠禁食12 h，其次，称取大鼠体重，之后腹腔内注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉。在大鼠颈部正中切口，长度约3 cm，分离肌肉及皮下组织，显示右侧颈总动脉(CCA)，继续向上分离颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，夹闭翼腭动脉(PPA)、甲状腺上动脉、枕动脉。在ECA近分叉插入制备好的栓子，深度为18～20 mm[3-4]。经CCA分叉处、ICA进入颅底至大脑前动脉(ACA)，阻断大脑中动脉(MCA)血流，固定栓子。再灌注时再次麻醉大鼠，栓子退回至CCA的分叉处，实现再灌注。治疗组分别予缺血再灌注前后经腹腔注射EPO 3 000 IU/(kg·d)，或缬沙坦40 mg/(kg·d)。

1.2.2 动物分组 将符合实验要求的SD大鼠按以下分为7组，每组10只。①空白对照组(A组)：MCAO前后不用药物干预；②促红细胞生成素处理组(B组)：再灌注后给予促红细胞生成素7 d，1次/d，每次3 000 U/kg；③ARB处理组(C组)：再灌注后使用ARB；④促红细胞生成素预处理组(D组)：再灌注前给予促红细胞生成素，3 000 U/kg；⑤ARB预处理组(E组)：再灌注前给予ARB处理；⑥促红细胞生成素和ARB联合使用组(F1组)：再灌注前给予促红细胞生成素和ARB；⑦促红细胞生成素和ARB联合使用组(F2组)：再灌注后给予促红细胞生成素和ARB。

1.2.3 神经功能评分 0分：无神经功能缺失；1分：对侧前肢屈曲；2分：向对侧旋转；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.2.4 脑含水量(BWC)测定(干湿重法) 取大鼠脑组织，分别将缺血侧和梗死对侧大脑半球组织放置于称量杯，分析天平称湿重。恒温箱内100 ℃烘烤24 h后取出，称干重(两次干重之差≤0.2 mg)，脑组织含水量计算公式：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.5 脑梗死体积率测定(TTC染色方法) 在冠状切面切约2 mm厚的5片脑片，予2%的TTC溶液中孵育15～20 min，温度37 ℃。予4%多聚甲醛固定，24 h后观察。采用TD2000图像分析系统测定脑梗死体积。采用Swanson方法纠正水肿对梗死灶体积的影响，梗死面积=非缺血侧半球面积-缺血侧半球未梗死区面积，梗死侧体积和非缺血侧半球体积的百分比(%)来表示梗死灶体积。见图1。

图1 脑梗死体积

2 结果

2.1 神经功能评分 与缺血再灌注组比较，治疗组的神经功能缺损评分低，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗组中以促红细胞生成素和ARB预处理组神经功能缺血评分最低，差异有统计学意义(P<0.05)，促红细胞生成素预处理组评分低于缺血再灌注后使用促红细胞生成素，差异有统计学意义(P<0.05)，但ARB治疗组两组分值比较差异无统计学意义。见表1。

表1 促红细胞生成素和ARB对大鼠脑缺血神经功能缺损评分的影响±s)

注：与缺血再灌注组比较，*P<0.05；与EPO处理组比较，#P<0.05

2.2 脑含水量 本实验观察了MCAO后大鼠脑组织的含水量，治疗组均可减少脑组织含水量，与缺血再灌注组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，促红细胞生成素和ARB预处理组减少脑组织含水量最明显，差异有统计学意义(P<0.05)，促红细胞生成素预处理组优于缺血再灌注后使用促红细胞生成素，差异有统计学意义(P<0.05)，但ARB治疗组两组比较差异无统计学意义。见表2。

表2 促红细胞生成素和ARB对大鼠脑缺血脑组织含水量的比较(ng/mL)

注：与缺血再灌注组比较，*P<0.01；与EPO处理组比较，#P<0.01

2.3 脑梗死体积 大鼠脑缺血后，观察大体标本，看到缺血侧脑组织较对侧体积增大，TTC染色呈白色的梗死灶，周围正常组织呈红色。治疗组脑梗死体积率与缺血再灌注组比较差异有统计学意义(P<0.01)，促红细胞生成素和ARB预处理组减少脑梗死体积最明显，差异有统计学意义(P<0.05)，促红细胞生成素预处理组优于缺血再灌注后使用促红细胞生成素，差异有统计学意义(P<0.05)，但ARB治疗组两组比较差异无统计学意义。见表3。

表3 促红细胞生成素和ARB对大鼠脑缺血脑梗死体积的比较±s)

注：与缺血再灌注组比较，*P<0.01；与EPO处理组比较，#P<0.05

3 讨论

EPO是调节红细胞生成的糖蛋白，主要产生于胎儿的肝脏和成人的肾脏，通过神经保护、抗细胞凋亡、抗炎、抗氧化、促进血管生成、促进神经发育及营养神经等在中枢系统疾病中发挥着重要作用。国内学者的研究认为，促红细胞生成素是一种神经保护因子，对局灶性和全脑梗死均有保护作用[5-6]。Byts等[7]认为，脑缺血、脑出血及脑外伤均可引起EPO及其受体在脑内多种细胞中表达，且表达明显上调，EPO可通过血脑屏障抗炎、抗凋亡等发挥脑保护作用。

本研究发现，缺血再灌注前使用EPO与缺血再灌注后使用相比较，可明显改善神经功能，减少梗死体积，降低梗死组织含水量。EPO对缺血大鼠脑组织的保护作用可能通过减少神经细胞的坏死和凋亡，因而也减少了脑组织的梗死体积和脑水肿，从而抑制缺氧缺血后脑皮层尤其是缺血半暗带细胞的凋亡。与Price等[8]使用EPO衍生物的研究结果一致。本实验通过腹腔给予外源性EPO起到了脑保护作用，间接地证实了EPO可以进入颅内发挥作用。除了特异性转运体外，还可能通过受损的血脑屏障进入脑内发挥作用。而且本研究同国内外临床及动物实验研究结果相一致。国外学者Fletcher等[9]通过阻塞大脑中动脉1 h，再灌注24 h建立动物模型，联合使用EPO 和胰岛素样生长因子，发现24 h后的梗死面积明显缩小，90 d后的神经功能明显改善。Yuen等[10]的研究结果同样证实，EPO可以缩小缺血面积，提高感觉、神经功能。Dang等[11]通过阻塞大鼠中动脉制造局造性脑缺血模型，血管内局部注人重组促红细胞生成素(rhEPO)，观察其脑保护作用，研究发现，其可以改善神经功能，缩小脑缺血48 h后的梗死体积，减轻脑水肿和细胞损害。临床试验亦发现，rhEPO有脑保护作用。Ehrenreich等[12]通过入选年龄<80岁，弥散加权磁共振成像(DWMRI)证实大脑中动脉区域缺血，起病8 h内，有神经功能缺失的患者，研究rhEPO在男性缺血性中风患者治疗中的有效性。通过Barthel Index，modified Rankin scale评价30 d的神经功能，证明可以改善预后，且脑脊液中rhEPO是对照组中的60～100倍，说明rhEPO可以通过血脑屏障。进一步通过MRI观察rhEPO可以缩小梗死体积。

生化及神经生物学表明，脑内存在独立调节的肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system，RAS)，研究表明，ARB能通过血脑屏障，与中枢神经系统内的AT1受体特异性结合，从而阻断血管紧张素Ⅱ的作用，说明其对脑血管具有保护作用。多项研究显示，ARB能预防或延缓卒中的发生并提高生存率。

ARB可通过调节核转录因子的表达，诱发炎症、免疫反应、细胞凋亡和自由基损伤及调节生物活性物质、细胞因子的释放等多种途径参与慢性脑缺血后脑保护过程。如：血管紧张素ATI受体拮抗剂可以降低血液中的超氧化物水平，因而可能通过抗氧化应激保护神经元；ARB可以减少兴奋性氨基酸通过NMDA受体诱导的细胞凋亡；动物实验证实ACEI和AT1受体拮抗剂分别通过减少AngⅡ生成和阻断AngⅡ与受体结合产生的生物学效应减轻缺血再灌注损伤。

本实验研究发现，ARB能明显缩小缺血动物的脑梗死体积，降低脑组织的含水量，表明ARB对实验动物神经细胞有明显的保护作用。Lou等[13]向雄性大鼠脑室内注射伊贝沙坦，观察神经保护、抗凋亡和炎症反应，发现缺血前使用伊贝沙坦预处理治疗可以提高运动功能，而缺血后使用可以提高感觉功能，AT1受体拮抗剂的使用降低了缺血后第3天和第7天的梗死体积，降低了第3天凋亡细胞的数量，减弱了第3天和7天活化的小胶质细胞和巨噬细胞的侵入，而抗凋亡机制及抑制缺血后的炎症反应，参与了神经保护。Hosomi等[14]对SD大鼠行缺血再灌注。奥美沙坦灌注7 d，观察中风指数，脑梗死体积，及血管紧张素Ⅱ和基质金属蛋白酶(MMP)定量检测。结果表明，小剂量奥美沙坦无降压作用，但能改善中风指数，脑梗死体积、脑水肿，亦能降低缺血区域血管紧张素Ⅱ、MMP2、MMP9的水平。亦有动物实验研究表明，阻塞大鼠中动脉1 h，制造短暂性脑缺血模型，单独使用AT1受体拮抗剂坎地沙坦或与羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂罗苏伐他汀联合使用，评估脑梗塞的体积和进行神经功能评分，结果表明，阻塞前2 h使用坎地沙坦预处理的，梗塞的体积为(21±5) mm3，阻塞后使用的为(68±29) mm3，对照组为(109±12) mm3，相比较差异有统计学意义，且阻塞前联合使用坎地沙坦和罗苏伐他汀与阻塞前单独使用剂坎地沙坦相比差无统计学意义，治疗的益处部分是由于eNOS的激活[15]。Faure等[16]研究发现，联合使用EPO和奥美沙坦可改善预后，明显提高长期空间学习记忆功能。

总之，EPO是一种不良反应小、安全的药物，可以在脑缺血损伤时通过血脑屏障进入脑组织发挥脑保护作用，减少梗死体积和脑水肿，且Meta分析亦进一步证实了此观点[17]。我们期望随着研究的深入，EPO将作为一种安全高效的神经保护剂应用于脑血管病的治疗。ARB可从多个方面干预慢性脑缺血后的神经元、突触、髓鞘的损害，有明显脑保护作用，能明显减轻慢性脑缺血引起的神经损害，为ARB在临床应用于预防和治疗慢性脑缺血提供了理论依据。

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Effects of erythropoietin and angiotensin receptor blocker on histological changes of cerebral infarction size and brain tissue water content

LIU Hui-li,LIANG Li-zhen,WU Chun-li

(Department of Neurology,The Third Hospital of Hangzhou,Hangzou 310009,China)

Objective To explore the protective effects of erythropoietin (EPO) and angiotensin receptor blocker (ARB) after focal cerebral ischemia-reperfusion.Methods The model of focal cerebral ischemia was made by occluding middle cerebral artery (MCAO) for 2 h and reperfusing for 24 h in well SD rats.The rats

an ip injection of either EPO 3 000 IU/(kg·d) or ARB 40 mg/(kg·d) just before the beginning of reperfusion and after reperfusion.The nerve function,changes of infarction volume to whole cerebral volume,brain tissue water content were evaluated.Results Compared with ischemia group,the cerebral infarction volume in EPO-treated group was smaller,and the cerebral water content also decreased,nerve function improved,there were significant differences between the two groups (P<0.05).Compared with ischemia group,the cerebral infarction volume in ARB-treated group was smaller,and the cerebral water content also decreased,there were significant differences between the two groups (P<0.05).Conclusion Erythropoietin and angiotensin receptor blocker can decrease the infarction volume,the cerebral water content,improve nerve function,by erythropoietin and angiotensin receptor blocker preconditioning,the result is more well,and has protective effects on ischemia-reperfusion.

Erythropoietin;Angiotensin receptor blocker;Cerebral ischemia

2013-06-04

浙江省杭州市第三人民医院神经内科，浙江 杭州 310009

杭州市医药卫生科技计划项目(2007A012)