醋酸氯己定与乙醇的协同杀菌效果

陈 羽， 李 飞， 张春梅， 徐 威*

(1.沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳鑫卓越药械进出口有限公司，辽宁 沈阳 110021)

醋酸氯己定与乙醇的协同杀菌效果

陈 羽1， 李 飞1， 张春梅2， 徐 威1*

(1.沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳鑫卓越药械进出口有限公司，辽宁 沈阳 110021)

采用悬液定量杀菌试验，对醋酸氯己定与乙醇的协同杀菌效果进行了实验室研究。研究发现，0.1%醋酸氯己定与75%乙醇混合溶液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白假丝酵母菌和黑曲霉均呈现出显著的协同杀菌作用。结果表明，醋酸氯己定与乙醇具有良好的协同杀菌效果。

醋酸氯己定；乙醇；悬液定量杀菌试验

醋酸氯己定是最常用的双胍类化合物之一，具有极强的广谱抑菌、杀菌作用且毒性低，在生产生活中应用广泛[1]。其主要作用机制是破坏病原微生物的原生质膜，快速杀死革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌等[2]。体积分数为70%～75%乙醇是最为普遍使用的一种消毒剂，具有无特殊气味、不留残渣、价格便宜等优点，其杀菌机制是去除细菌胞膜中的脂类，并使菌体蛋白质变性[3]。醋酸氯己定与乙醇皆属于常用的消毒剂，但单独使用时，其消毒效果往往受到微生物的种类、温度、浓度和pH值等因素的影响。本文作者对醋酸氯己定与乙醇的协同杀菌效果进行了实验室研究，为药厂合理开发复合消毒剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌种 金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、大肠埃希菌(Escherichiacoli8099)、白假丝酵母菌(CanidiaalbicansATCC 10231)和黑曲霉(Aspergillius niger ATCC 16404)由沈阳药科大学微生物学与细胞生物学教研室提供。

1.1.2 培养基(g/L) 营养琼脂培养基：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，氯化钠5.0，琼脂粉14.0；沙堡琼脂培养基：葡萄糖40.0，蛋白胨10.0，琼脂粉14.0。

1.1.3 缓冲液(g/L) 标准硬水：氯化钙0.304，氯化镁0.139；磷酸盐缓冲液：无水磷酸氢二钠2.83，磷酸二氢钾1.36，pH 7.2；中和剂：硫代硫酸钠5.0，溶解于磷酸盐缓冲液中。

1.1.4 消毒液的配置 取0.1 g醋酸氯己定(锦州九泰药业有限责任公司，批号：101109)，用标准硬水定容至100 mL，即0.1%醋酸氯己定消毒液。取79 mL体积分数95%乙醇(沈阳富康消毒药剂厂，批号：20130318)，用标准硬水定容至100 mL，即75%乙醇消毒液。取0.1 g醋酸氯己定，用75%乙醇消毒液定容至100 mL，即复合消毒剂。

1.2方法

1.2.1 菌悬液的制备 取磷酸盐缓冲液5.0 mL加入新鲜斜面培养物试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用移液管将洗液移至另一无菌试管中，用涡旋混合器振荡20 s，使菌体悬浮均匀。初步制成的菌悬液，先用比浊测定法测其含菌浓度，然后用磷酸盐缓冲液稀释至1×1011～5×1011cfu/L。菌悬液在使用时应先进行活菌培养计数。

1.2.2 中和剂的考察试验 以S.aureusATCC 6538为试验菌，按悬液定量杀菌试验程序进行[4]。设平行6组试验：a组为消毒液+菌悬液；b组为(消毒液+菌悬液)+中和剂；c组为中和剂+菌悬液；d组为(消毒液+中和剂)+菌悬液；e组为磷酸盐缓冲液+菌悬液(正常菌对照)；f组为磷酸盐缓冲液+中和剂+培养基(阴性对照)。中和剂及其浓度的判定标准：a组不长菌或仅有极少数菌落生长；b组有菌落生长，较a组为多，但较c、d、e组为少；c、d、e组菌落数分别在1×108～5×109cfu/L内，且组间菌落数误差率不应超过15%；f组无菌生长。借此可判定所选中和剂及其浓度是否适宜。

1.2.3 黑曲霉孢子悬液的制备 用接种环划线接种A.nigerATCC 16404于沙堡斜面培养基上，置28 ℃恒温培养箱中培养10 d。吸取0.05%吐温-80水溶液4 mL置于斜面表面，刮洗分生孢子，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇30 min后，滤过除去菌丝，备用。

1.2.4 悬液定量杀菌试验 试验时，先将内装5 mL消毒液的试管置于20 ℃水浴中5 min，再将菌悬液0.1 mL加入其中，混匀，作用至规定时间。取混和液0.5 mL，移入含有4.5 mL中和剂溶液的试管中，混匀，中和作用10 min。取0.1 mL涂平板，置恒温培养箱内培养，活菌计数。以内装5 mL标准硬水的试管同步操作所得活菌数为基准，计算杀菌率。

1.2.5 评价指标 协同系数(T/E)=各因子单独作用时微生物存活百分率之乘积/多因子共同作用实测微生物存活百分率(其中，存活率为0时，按0.000 1%计算)。T/E值为判断复合增效作用强弱的标准。T/E值小于1为拮抗作用，等于1为相加作用，大于1为增效作用，其值越大，增效作用越强[5]。

1.2.6 模拟现场试验 选择木质桌面，在桌面上划定5 cm×5 cm范围的4个不同区域，分别标记为基准区、醋酸氯己定区、乙醇区和复合消毒剂区。以涂抹法污染E.coli8099悬液(菌数为1×107cfu/L)，待自然干燥后进行试验。消毒前，将无菌棉拭于5 mL磷酸盐缓冲液试管中沾湿，以涂抹法在基准区采样作基准；将0.1%醋酸氯己定、75%乙醇及0.1%醋酸氯己定+75%乙醇复合消毒剂分别均匀喷涂在各自所属区域，作用10 min，以同样方法进行消毒后采样。分别将消毒前后采样棉拭采样端剪入5 mL中和剂试管内，振打80次，活菌计数，观察杀菌效果。

2 结果与分析

2.1中和剂的考察结果

经检测，用含0.5%硫代硫酸钠可分别有效中和0.1%醋酸氯己定、75%乙醇以及复合消毒剂的杀菌作用，中和剂及中和产物对受试菌及培养基均无影响(表1)。

2.2复合消毒剂对金黄色葡萄球菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对S.aureusATCC 6538的协同杀菌能力较醋酸氯己定和乙醇单独作用时强(表2)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为563.88，起到了显著的增效作用。

表1 消毒剂的中和剂试验结果

表2 复合消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭效果

2.3复合消毒剂对大肠埃希菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对E.coli8099的协同杀菌能力较醋酸氯己定和乙醇单独作用时强(表3)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为159.28，起到了显著的增效作用。

表3 复合消毒剂对大肠埃希菌的杀灭效果

2.4复合消毒剂对白假丝酵母菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对C.albicansATCC 10231的协同杀菌能力较醋酸氯己定和乙醇单独作用时强(表4)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为3 353.76，起到了显著的增效作用。

表4 复合消毒剂对白假丝酵母菌的杀灭效果

2.5复合消毒剂对黑曲霉的协同杀菌作用

复合消毒剂对A.nigerATCC 16404的协同杀菌能力较醋酸氯己定和乙醇单独作用时强(表5)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为914.94，起到了显著的增效作用。

表5 复合消毒剂对黑曲霉的杀灭效果

2.6模拟现场试验

用醋酸氯己定、乙醇以及复合消毒剂进行模拟现场试验。试验结果表明：醋酸氯己定、乙醇及复合消毒剂对E.coli8099悬液作用10 min，杀菌率分别为95.96%、99.32%和100%。说明该复合消毒剂具有明显的协同杀菌优势，为药厂开发复合消毒剂提供参考依据。

3 讨 论

随着人们对消毒重要性认识的逐步提高，各种高效、低毒、安全的新型消毒剂不断问世，很多已经应用于临床和家庭中，对常见的细菌、真菌的杀灭和抑制作用都很明显。目前，国内外均致力于寻求高效、广谱、快速的杀菌消毒剂[6]。

醋酸氯己定是一种较好的杀菌消毒剂，具有相当强的广谱抑菌、杀菌作用。随着消毒剂的长期使用，各种病原微生物对其耐药性也在逐年增加。目前，单纯的醋酸氯己定产品并不多见，开发新型醋酸氯己定复配系列产品，具有广阔的市场应用前景。本研究采用悬液定量杀菌试验，以协同系数T/E值作为评价指标，对醋酸氯己定与乙醇的协同杀菌效果进行了实验室研究。结果表明，0.1%醋酸氯己定+75%乙醇复合消毒剂协同作用可以克服单一消毒剂存在的不足，对某些细菌(S.aureusATCC 6538、E.coli8099)、某些酵母菌和曲霉菌(C.albicansATCC 10231、A.nigerATCC 16404)均起到了显著的协同杀菌效果，为将来药厂开发新型醋酸氯己定乙醇复配产品提供了理论依据。

[1] 王晓蕾，陈文森，朱铭洪，等.一种复方醋酸氯己定外科手消毒液的杀菌效果观察[J].中国消毒学杂志，2013，30(1)：4-5.

[2] 姚四新，刘保国.洗必泰配制方法的改进及其消毒效果[J].中国兽医杂志，2003，39(8)：46-47.

[3] 李士娥，赵海英，付伟，等.影响酒精杀菌作用的因素与对策[J].职业与健康，2000，16(6)：76.

[4] 卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].北京：中华人民共和国卫生部，2002：9-200.

[5] 聂绍发，朱贵宝，林天晖，等.新洁尔灭与戊二醛协同杀菌作用的实验研究[J].同济医科大学学报，2001，30(1)：50-52.

[6] 刘富来，冯翠兰.TS植物消毒剂消毒效果的初步研究[J].中兽医医药杂志，2009，(2)：29-30.

·写作常识·

署名

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SynergicGermicidalEfficacyofChlorhexidineAcetateCombinedwithEthylAlcohol

CHEN Yu1, LI Fei1, ZHANG Chun-mei2, XU Wei1

(1.Schl.ofLifeSci. &Biopharm.,ShenyangPharm.Uni.,Shenyang110016; 2.ShenyangXinzhuoyueMed.DeviceImp&ExpCo.Ltd.,Shenyang110021)

In order to understand the synergic germicidal efficacy of chlorhexidine acetate combined with ethyl alcohol, suspension quantitative germicidal test was used to carry out laboratory study. It was found chlorhexidine acetate (0.1%) combined with ethyl alcohol (75%) had obviously synergetic germicidal efficacy againstStaphyloccocusaureusATCC 6538,E.coli8099,CandidaalbicansATCC 10231, andAspergilliusnigerATCC16404.Theresultsshowedthatchlorhexidineacetatecombinedwithethylalcoholhadfinesynergeticgermicidalefficacy.

chlorhexidine acetate; ethyl alcohol; suspension quantitative germicidal test

陈羽 男，硕士，讲师。主要从事微生物制药及消毒剂杀菌消毒的研究。E-mail: gzweishengwu@126.com

2013-08-29；

2013-09-11

Q815

B

1005-7021(2014)04-0093-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.04.019

* 通讯作者。女，博士，教授，硕士生导师。主要从事微生物制药及微生物转化合成生物活性物质的研究。

Tel: 024-23986400，E-mail: shxuwei8720@163.com