胰蛋白酶原激活肽和C-反应蛋白对大鼠急性胰腺炎的诊断价值

栾 涛，张红军，万建平，王雅丽，胡永胜，王 曦，夏越超

胰蛋白酶原激活肽和C-反应蛋白对大鼠急性胰腺炎的诊断价值

栾 涛1，张红军1，万建平2，王雅丽1，胡永胜1，王 曦1，夏越超1

目的探讨血清胰蛋白酶原激活肽(trypsinogen activation peptide, TAP)和C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)在大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)发生、发展中的作用。方法将96只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组和AP组，每组48只。假手术组仅打开腹腔翻动胰腺数次后关腹，AP组建立急性胰腺炎动物模型，两组在造模后3、6、12、24 h四个时点分批处死。每只大鼠处死前腹主动脉采血5 ml，取胰腺组织进行HE染色并做病理评分。应用ELISA法定量检测各组大鼠血清TAP和CRP的含量。结果(1)AP组胰腺组织病理评分随造模时间延长明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)假手术组与AP组造模后同时点比较，TAP水平差异均有统计学意义(P<0.05)，假手术组各时点间比较，TAP水平均无统计学差异(P>0.05)，AP组造模后3 h(1.41±0.19)、6 h(2.09±0.33)、12 h(3.16±0.23)、24 h(4.53±0.28)四个时点比较，TAP水平均有统计学差异(P<0.05)。(3)AP组造模后各时点间比较，CRP水平均有统计学差异(P<0.05)。(4)血清TAP(r=0.942)、CRP(r=0.926)含量均与胰腺组织病理评分呈高度正相关(r>0.7，P<0.05)。结论血清TAP可作为早期诊断急性胰腺炎的可靠指标；对TAP和CRP动态检测可判断AP的严重程度。

急性胰腺炎；胰蛋白酶原激活肽；C-反应蛋白；大鼠

急性胰腺炎可分为轻症(mild acute pancreatitis，MAP)和重症(severe acute pancreatitis，SAP)两型，其中SAP并发症多，可表现为胰腺局部的炎性反应，全身炎性反应和胰外器官损伤[1]。造成AP 早期病理损害的主要机制是胰酶活化，炎性介质、细胞因子和氧自由基大量产生而引发机体超强的炎性反应[2]。在胰蛋白酶原被活化成胰蛋白酶的过程中，可以释放出特异性的产物——TAP，定量检测血清TAP变化可直接反映胰蛋白酶原的激活，是胰蛋白酶原激活的分子标志物，并具有高度的特异性，可作为临床上早期诊断和评估AP患者病情轻重的一个良好指标。CRP是一种机体急性期反应蛋白，是非常敏感的炎性反应和组织损伤标志物。大量的研究证明，CRP在急性胰腺炎过程中的重要性，其水平高低与胰腺炎的严重程度及并发症相关[3，4]。本研究旨在通过对大鼠AP血清中CRP、TAP浓度动态测定，探讨血清TAP和CRP在急性胰腺炎发生、发展中的作用，为AP早期诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠，3～4月龄，体重(200±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK2004-0006，编号0000886。25 ℃条件下适应性喂养1周后进行实验。

1.2 设备与试剂 隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；高速低温离心机(上海力申科学仪器有限公司)；组织包埋机、轮转切片机(德国LEICA公司)；显微成像系统(尼康映像仪器销售有限公司)；酶标分析仪(深圳雷杜生命科学有限公司)；Excelsior ES自动组织脱水机(Thermo Scientific公司)；TAP ELISA试剂盒(上海史瑞克生物科技有限公司)；CRP ELISA试剂盒(上海信然生物技术有限公司)；牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)。

1.3 动物分组及模型制备 健康雄性Wistar大鼠96只，随机分成2个大组：假手术组和AP组，每组48只。各组实验大鼠术前禁食12 h，自由饮水。用22%乌拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧固定于手术台上，乙醇消毒手术域。进入腹腔，找到胰腺后，分别在胰头、胰体及胰尾部多点缓慢注射5%牛黄胆酸钠(natrii tauroglycocholas, Na-Tc)，总量按1 ml/kg计算。假手术组打开腹腔后，仅对胰腺翻动数次后关腹。造模后分组搁置，大鼠清醒后自由饮水。

1.4 标本采集 假手术组和AP组分别在造模后3、6、12、24 h四个时点分批处死，每个时点处死12只大鼠。解剖大鼠，观察胰腺大体病理变化；由腹主动脉采血5 ml，注入密封促凝采血管中静置1 h后，以3000 r/min低温离心10 min，分离血清用于TAP及CRP测定。取部分胰腺组织浸泡在10%甲醛液后备用。

1.5 测定项目及方法 对各组大鼠胰腺组织行病理切片HE染色，并进行胰腺组织病理评分(histopathologic scoring, HS)以评估胰腺组织病变损伤程度。应用ELISA法定量检测各组大鼠血清TAP及CRP含量。

2 结 果

2.1 胰腺组织病理改变 假手术组各时点胰腺腺泡结构正常，排列紧密。AP组随造模时间延长，胰腺腺泡结构逐渐消失，胰腺小叶间隙、腺泡间隙、细胞间隙逐渐增宽，血管周围有炎性细胞渗出；AP组造模后24 h，可见胰腺组织呈大片状坏死，有的整个小叶坏死，坏死区域腺泡结构消失，细胞玻璃样变、核溶解消失，胰周脂肪坏死(图1)。

图1 假手术组和AP组各时点大鼠胰腺病理变化(HE，×400)

2.2 胰腺组织病理评分、CRP、TAP含量检测 (1)AP组胰腺组织病理评分随造模时间延长明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；(2)假手术组与AP组造模后同时点比较，TAP水平差异均有统计学意义(P<0.05)，假手术组各时点间比较，TAP水平均无统计学差异(P>0.05)，AP组造模后各时点间比较，TAP水平均有统计学差异(P<0.05)；(3)假手术组造模后6 h与12、24 h比较，CRP浓度差异有统计学意义(P<0.05)。AP组造模后CRP水平随时间延长而升高，各时点间比较差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 假手术组与AP组各时点HE病理评分、TAP浓度、CRP浓度比较 ±s)

注： 与AP组造模后3 h比较，①P<0.05；与AP组造模后6 h比较，②P<0.05；与AP组造模后12 h比较，③P<0.05；与假手术组造模后3 h比较，④P<0.05；与假手术组造模后6 h比较，⑤P<0.05

2.3 TAP、CRP水平与胰腺病理评分的相关性 血清TAP(r=0.942)、CRP(r=0.926)含量均与胰腺组织病理评分呈高度正相关(r>0.7，P<0.05)。见图2、3。

图2 血清CRP浓度与胰腺病理评分的相关关系

3 讨 论

3.1 TAP在AP发病机制中的作用 AP的发病机制非常复杂，其发生发展受多种因素的影响[5，6]。目前比较公认的AP发病机制包括[7]：(1)胰腺自身消化学说；(2)白细胞过度激活—炎性因子学说；(3)氧化应激学说；(4)肠道细菌移位学说；(5)胰腺腺泡内钙超载学说；(6)胰腺微循环障碍学说。近年来研究发现，AP发病机制与始发的胰腺细胞内事件、早期炎性反应和晚期炎性反应等密切相关[8]。在生理状况下，胰腺能分泌十余种酶[9]，其中以胰淀粉酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、弹性蛋白酶等为主。当胰腺在各种致病因素的作用下，便释放出溶酶体水解酶，则酶原颗粒和水解酶通过一种吞噬现象而融合，致使酶原在细胞内活化；或者胰蛋白酶原流入十二指肠，受到肠液中肠激酶的激活作用后变为有活性的胰蛋白酶。在胰蛋白酶原被活化成胰蛋白酶的过程中，可以释放出特异性的产物——TAP。TAP是位于胰蛋白酶原氨基末端的激活肽，在哺乳动物中有高度同源性。一分子的胰蛋白酶原只产生一分子的TAP。急性胰腺炎所产生的TAP一般在发病数小时即可通过胰腺渗入腹腔，进入血液循环。Mansfield和Jones[10]通过实验与临床研究指出，急性胰腺炎时，TAP浓度的变化早于其病理变化。定量测定TAP可直接反映胰蛋白酶原的激活程度和胰腺损伤程度，具有高度的特异性，其浓度高低与病情严重程度相关[11]。本研究显示，在造模后3 h，当假手术组与AP组在胰腺病理组织学上无显著差异时，两组血TAP水平已有统计学差异，且随着造模时间的延长，AP组血TAP浓度与胰腺组织损伤程度呈正相关。故早期检测并动态观察血TAP浓度水平有助于AP的早期诊断和对AP严重程度的评估。

图3 血清TAP浓度与胰腺病理评分的相关关系

3.2 CRP在AP诊断中的作用 研究发现，多种炎性因子参与AP的发生发展，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素、CRP、血小板活化因子、磷脂酶A2等，这其中以CRP升高最为显著[12,13]。CRP是一种非常敏感的炎性反应和组织损伤标志物[14]，坏死性胰腺炎时CRP水平明显升高，可达正常值的18倍[15]。当感染和损伤发生时, 其浓度急剧上升，3～6 h开始升高，24～48 h达到峰值[16]，其水平高低反映炎性反应程度高低。目前许多研究认为，CRP浓度的高低与AP的严重程度及并发症相关，而CRP在AP的早期诊断中无明显特异性[17]。本研究显示，假手术组虽只对大鼠胰腺进行数次翻动后关腹，3 h后也可引起血清CRP浓度升高，6 h后逐渐下降，12 h后浓度差异已无统计学意义。与AP组造模后3 h比较，假手术组血清CRP浓度差异无统计学意义，进一步证实CRP是一种判断组织损伤和炎性反应的敏感标志物。而AP组由于炎性反应持续存在，血清CRP浓度持续升高，且随AP组造模时间的延长，与胰腺病理损伤呈正相关。

综上所述，本研究显示，早期联合动态检测血清TAP和CRP浓度有助于早期诊断AP，并可为早期评估AP严重程度提供依据。

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(2014-01-02收稿 2014-06-09修回)

(责任编辑 尤伟杰)

CorrelationstudybetweenbothtrypsinogenactivationpeptideandC-reactiveproteinwithacutepancreatitisinrats

LUAN Tao1，ZHANG Hongjun1， WAN Jianping2, WANG Yali1, HU Yongsheng1，WANG Xi1，and XIA Yuechao1. 1.Department of General Surgery，Liaoning Provincial Crops Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Shengyang 110034，China; 2.The outpatient department of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100089, China

ObjectiveTo study the role of serum TAP and CRP in occurrence and development of acute pancreatitis(AP) in rats. It can provide a theory basis for early diagnosis of AP.Methods96 specific pathogen free(SPF) Wistar male rats were divided into two groups randomly (n=48 in each group): sham-operated group and AP model group. In sham-operated group,we only opened the abdominal cavity and touched pancreas several times.In AP model group, 5% Na-Tc was injected under the membrane of pancreas to establish AP animal model. The rats were killed at 3 rd, 6 th, 12 th and 24 th hour after modeling in each group. A portion of pancreatic tissues was examined by hematoxylin-eosin(HE) staining. We detected the concentration of TAP and CRP in serum by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) .ResultsThe concentration of TAP in sham-operated group, compared with AP group at the same time, was significantly different (P<0.05). The concentration of TAP in AP group had significant differences (P<0.05) compared with each other. The concentration of CRP in sham-operated group at 6th, 12th, 24th hour compared with AP group at the same time was significantly different (P<0.05). The concentration of CRP in AP group had significant differences (P<0.05) compared with each other. The concentration of TAP and CRP showed higher positive correlation with the pancreatic histopathologic scores.ConclusionsSerum TAP can be used for diagnosis of AP in early stage for judgment. TAP and CRP detected dynamically in AP in early stage can be used as indicators of serverity, which plays an important role in forecasting AP.

acute pancreatitis;trypsinogen activation peptide;C-reactive protein;rat

栾 涛，硕士，主治医师，E-mail：luantao13099@126.com

1. 110034沈阳，武警辽宁总队医院普外科；2. 100089北京，武警总部机关门诊部

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