依达拉奉对实验性小鼠自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用

郑慧敏，刘世军，孙克明，刘宪勇, 郭俊青

依达拉奉对实验性小鼠自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用

郑慧敏1，刘世军1，孙克明1，刘宪勇1, 郭俊青2

目的研究依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠的抑制作用。方法将60只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组：正常对照组、EAE组、EAE+依达拉奉组，每组20只。正常对照组用PBS作为对照。后两组应用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55、完全福氏佐剂(CFA)、结核分枝杆菌，制成的抗原乳剂进行造模。免疫2 d后，EAE+依达拉奉组腹腔注射依达拉奉5 mg/(kg·d)。3组均监测20 d，每日称重，观察小鼠的摄食和发病情况，并进行神经功能评分。20 d后取小鼠脊髓组织，进行病理学观察。结果EAE组小鼠的发病率(80%)高于EAE+依达拉奉组(45%)，差异有统计学意义(P<0.05)。EAE+依达拉奉组神经功能评分各个时间点都低于EAE组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中，监测10 d后，EAE组神经功能评分(3.6±0.4)级；而EAE+依达拉奉组评分为(1.3±0.5)级。HE染色后发现，EAE组小鼠的脊髓内有大量的炎性细胞浸润，白质脱髓鞘改变明显。而EAE+依达拉奉组小鼠有较少的炎性细胞浸润，且没有白质脱髓鞘改变。结论依达拉奉对EAE的保护作用可能与其清除自由基、减轻炎性反应有关。

依达拉奉；实验性自身免疫性脑脊髓炎；多发性硬化

多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是发生在中枢神经系统的自身免疫性脱髓鞘疾病，多次反复发作或病程进展迅速可导致运动障碍，最终全身瘫痪[1]。该病病因和发病机制尚不明确，近年来越来越多的研究表明，自由基损伤可能与MS的发病密切相关[2]。依达拉奉是一种新型的自由基清除剂，一方面具有直接清除自由基、减轻血脑屏障破坏等作用；另一方面能通过抑制次黄、黄嘌呤氧化酶的活性，减少炎性介质白三烯等的生成，并抑制迟发性神经元死亡[3]。本研究通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型，给予依达拉奉注射液进行干预，观察小鼠的发病率、神经功能损伤情况及病理学改变，探讨依达拉奉对EAE小鼠的抑制作用，为临床治疗干预MS提供新思路、新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及药物 免疫抗原MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由美联(西安)生物科技有限公司合成，经质谱及HPLC色谱分析，纯度>95%，完全福式佐剂(CFA, Sigma)与百日咳毒素(PT)均购自上海生物制品研究所。

1.1.2 实验动物 雌性C57BL/6小鼠60只，4～6周龄，体重11～15 g。清洁级，以标准饲料喂养，饮用自来水，环境恒温20～25 ℃。购自上海斯莱克实验动物有限公司。合格证号：SCXK(沪)2007000532247。

1.2 方法

1.2.1 分组及EAE模型的建立 60只小鼠随机分为：正常对照组、EAE组和EAE+依达拉奉组3组，每组20只。用0.01 mol/L的磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)将MOG35-55稀释成300 μg/ml，再用完全福氏佐剂(CFA)将结核分枝杆菌稀释成4 mg/ml。用注射器抽打至油包水状态，制成诱导EAE的抗原乳剂。正常对照组用PBS作为对照，EAE组、EAE+依达拉奉组小鼠分别腹股沟皮下注射相应抗原，100 μl/只，记免疫当天为0 d，于0、2 d给予小鼠腹腔注射百日咳毒素200 μl/只。免疫后2 d，给予EAE+依达拉奉组小鼠腹腔注射依达拉奉5 mg/(kg·d)，1次/d，连续给予20 d。

1.2.2 体质量监测及神经功能评分 免疫当天开始，每日称重，观察小鼠的摄食和发病情况，并进行神经功能评分，连续观察20 d。神经功能评分标准为通用的0～5级评分法：0级，不发病；1级，小鼠尾部张力降低或麻痹；2级，小鼠尾部麻痹，后肢无力；3级，小鼠后肢瘫痪；4级，小鼠四肢瘫痪，人为翻身不能复位；5级，濒死状态或发病后死亡[1]。

1.2.3 组织取材与病理学检查 自免疫后20 d，腹腔注射2%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉各组所有小鼠，在无菌条件下剖开胸腔，暴露心脏，经左心室灌注PBS至肝脏变白，然后改用4%多聚甲醛灌注固定，随后立即取出脑和脊髓浸入甲醛中固定。常规石蜡包埋后制成5 μm厚的切片，HE染色，并在光镜下观察炎性细胞浸润及脱髓鞘改变[1]。

2 结 果

2.1 发病率及临床表现 正常对照组无一只发病。EAE组发病 16 只，发病率80%；EAE+依达拉奉组发病9只，发病率 45%；两组比较，差异有统计学意义(P=0.023)。后两组发病开始于免疫后8 d，约在10 d达到发病高峰。主要表现为食欲下降、体重减轻。同时，EAE组小鼠中枢神经系统受损症状明显，表现为尾部无力拖垂，步履蹒跚，后肢瘫痪，行动困难，病情进一步发展表现为四肢瘫痪。

2.2 神经功能评分 免疫后20 d内EAE组和EAE+依达拉奉组神经功能评分见表1，两组均在免疫后8 d评分开始增高，并随着免疫时间的延长，评分逐渐升高，16 d后，评分开始下降。与EAE组比较，EAE+依达拉奉组在不同时间的评分均低，差别有统计学意义(P<0.05)。EAE组小鼠最高神经功能评分为4级，10 d时评分为(3.6±0.4)级；EAE+依达拉奉组最高为3级，10 d时评分为(1.3±0.5)级。

表1 免疫后两组小鼠的神经功能评分 ±s；级)

注：4、6 d的评分两组均为0

2.3 病理学检查 正常对照组小鼠脊髓未见明显异常。EAE组小鼠脊髓的实质中有大量的炎性细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，病变主要集中在脊髓腰膨大的白质区，在白质区可见大小不等的髓鞘脱失区，而且髓鞘脱失区程度与EAE小鼠的临床症状的严重程度直接相关。而EAE+依达拉奉组小鼠脊髓的实质中仅有少量的炎性细胞浸润，且没有髓鞘脱失。结果见图1。

图1 小鼠脊髓组织的病理检查结果(HE)

3 讨 论

MS是一种中枢神经系统脱髓鞘疾病，以青、中年多见，临床特点是病灶播散广泛，病程中常有缓解复发的神经系统损害症状，目前尚无特殊治疗方法，且往往预后不佳。EAE小鼠模型是公认的MS动物模型[4]，本研究中，EAE组小鼠自免疫后8 d开始发病，约在20 d达到发病高峰，最高神经功能评分为4级。

依达拉奉是一种脑保护药(自由基清除剂)，大量研究证实其对缺血动物实验模型有清除自由基、抗脑水肿、缩小梗死体积及改善神经功能等保护作用[5-9]。作为新型自由基清除剂、抗氧剂，已广泛应用于急性脑梗死的治疗中。文献[10]提示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。

本研究中，EAE组的神经功能缺损程度最严重，细胞形态学显示脊髓组织多可见大量炎性病灶，以淋巴细胞和巨噬细胞为主。在使用依达拉奉干预后，神经功能缺损程度减轻，血管周围炎性浸润细胞数减少，且细胞学形态改善更明显，结果显示依达拉奉对EAE具有神经保护作用。经依达拉奉干预后，EAE+依达拉奉组小鼠的发病率为45%，明显低于EAE组。

本研究结果表明，依达拉奉能减轻EAE病情严重程度，改善病变区域病理形态学表现，对EAE具有保护作用，其保护作用可能与其清除自由基、减轻炎性反应有关。本研究对依达拉奉治疗MS 提供了新的思路。

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(2014-02-05收稿 2014-04-10修回)

(责任编辑 武建虎)

Inhibitingeffectofedaravoneonexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinmice

ZHENG Huimin1, LIU Shijun1, SUN Keming1, LIU Xianyong1，and GUO Junqing2. 1. Department of Pharmacy, Shandong Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014, China；2. Outpatient Department of Shandong Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014, China

ObjectiveTo study the inhibiting effect of edaravone on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model.MethodsSixty female C57BL / 6 mice were randomly divided into three groups: normal control group, EAE group, EAE + edaravone group (n=20), normal control group with PBS as a control. The application of myelin oligodendrocytes glial cells glycoprotein 35-55 and complete Freund’s adjuvant (CFA) and Mycobacterium tuberculosis antigens emulsions were made modeling in the later two groups. After 2 days immunization, EAE+edaravone group were injected at a dose of 5 mg/(kg·d) of edaravone. Three groups were monitored 20 days, daily weighing, feeding and incidence were observed, and neurological function was scored. Mouse spinal cord tissue was obtained for pathological examination after 20 days.ResultsIn EAE+edaravone treated mice, compared with EAE mice, the incidence and neurological function scores were significantly low (P<0.05). The incidence in EAE group was 80%, while the incidence in EAE+ edaravone group mice was 45%. Monitored for 10 days, in EAE group mice, neural function score was 3.6±0.4, while in EAE+ edaravone group mice neural function score was 1.3±0.5. HE staining found a large number of inflammatory cell infiltration in EAE mice spinal cord, and white matter demyelination was obvious. Nevertheless edaravone group mice had fewer inflammatory cell infiltration, and no white matter demyelination.ConclusionsProtective effect of edaravone on EAE is related to scavenging free radicals and reducing inflammation.

edaravone; experimental autoimmune encephalomyelitis; multiple sclerosis

郑慧敏，硕士，主管药师，E-mail: zhm1216@126.com

1.250014济南，武警山东总队医院药剂科；2.250014济南，武警山东总队机关门诊部

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