白介素-1β对人牙周膜成纤维细胞MMP-13表达影响的研究

晏 燕，周 云，壮 荣，曹 军

白介素-1β对人牙周膜成纤维细胞MMP-13表达影响的研究

晏 燕，周 云，壮 荣，曹 军

目的 探讨白介素-1β(IL-1β)对人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)中基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达影响的研究。方法 体外分离培养hPDLFs并随机分为对照组和实验组，对照组中加入等量无血清培养液，实验组加入不同浓度IL-1β(0 ng/ml、0.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)作用hPDLFs 24 h。采用RT-PCR检测MMP-13 mRNA的表达情况，并选取最适浓度作用24 h，采用Western blot检测MMP-13蛋白表达的变化情况。结果 实验组与对照组比较，MMP-13在IL-1β浓度为10 ng/ml和20 ng/ml时mRNA表达最为明显(P<0.05)，10 ng/ml组和20 ng/ml组MMP-13 mRNA表达相比较，无明显差异(P>0.05)。采用10 ng/ml IL-1β作为最适浓度进行刺激，并作用hPDLFs 24 h，与对照组比较，MMP-13蛋白表达显著增加，具有显著差异性(P<0.05)。结论 在IL-1β调控下，hPDLFs中MMP-13的表达显著增加，并呈明显的浓度依赖性，而MMP-13表达的增加可能是引起正畸治疗过程中牙根吸收的重要机制之一。

基质金属蛋白酶-13；白介素-1β；人牙周膜成纤维细胞

正畸治疗的目的是高效移动牙齿，同时降低对牙齿及其牙周组织的伤害。而牙根吸收作为正畸治疗的一个不良反应在临床上很常见，但其具体的分子生物学机制却不明确[1-2]。有研究显示[3-5]，当牙根吸收时，其局部区域的牙周膜组织IL-1β表达明显增强，而MMP-13属于间质性胶原酶，可以降解牙周组织中最具特征的Ⅰ型胶原。本研究拟采用体外细胞学研究方法，运用RT-PCR及Western blot观察IL-1β对hPDLFs中MMP-13表达有何影响，初步探讨在正畸治疗发生的牙根吸收过程中，IL-1β与MMP-13之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料和设备 重组人IL-1β(Peprotech公司，美国)； RT-PCR试剂盒(Takara公司，日本)；鼠抗人MMP-13单克隆抗体(Abcom公司，美国)； MMP-13引物合成(上海生工公司)； RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；垂直电泳槽、电泳仪、Mini Trans-Blot转移电泳槽(Bio-Rad公司，美国)；倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)的原代培养 选取青少年正畸患者因正畸需要拔除的健康前磨牙，即刻放入含双抗的DEME液中，于超净台中反复用PBS液冲洗后，刮取根中1/3牙周膜组织，参照文献[6-7]进行组织块法进行原代培养，传代并扩大培养，用于以下实验。

1.2.2 MMP-13 mRNA表达的检测 取生长良好的第3～6代hPDLFs细胞，用2.5 g/L胰酶消化，调整细胞密度为1×105/ml并接种于6孔板，分别设置5个IL-1β浓度梯度组(0 ng/ml、0.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)，待细胞充分贴壁并达到80%汇合时，更换为无血清培养液继续培养24 h，使细胞进入相对同步化后，加入各不同浓度IL-1β，标准环境下继续培养24 h，将每孔均加入1 ml Trizol裂解hPDLFs约5 min，按步骤提取细胞总RNA。按照反转录试剂盒操作说明将RNA反转录成cDNA，取部分反转录样品直接进行qRT-PCR反应。相关引物由上海生工合成，引物序列如下：MMP-13：F：ACTGAGAGGCTCCGAGAAATG；R：GAACCCCGCATCTTGGCTT；β-actin：F：CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT；R：CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC。反应体系共25 μl。采用相对定量分析法分析。

1.2.3 Western blot法检测hPDLFs中MMP-13蛋白的表达 取生长良好的第3～6代hPDLFs细胞，用2.5 g/L胰酶消化后接种于50 ml培养瓶，取上述IL-1β最适浓度作为实验组，与加入等量无血清培养液的对照组比较。提取细胞总蛋白后，采用BCA法测定蛋白浓度，按照所测目的蛋白的大小，配置SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质电泳，采用湿转法，将蛋白质转移至PVDF膜上，将PVDF膜转移至含有50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭液中，摇床室温封闭2 h后。分别加入1∶1000稀释的MMP-13、GAPDH抗体中，4 ℃过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h。洗涤后，暗室内用ECL法在反应液中反应2～3 min后拍片显影。

2 结果

2.1 不同浓度IL-1β对hPDLFs中MMP-13表达的影响 从图1可看出，随着IL-1β作用的浓度升高，MMP-13 mRNA表达逐渐增高。当IL-1β达到10 ng/ml和20 ng/ml时，MMP-13 mRNA的表达与对照组相比有显著的差异性(P<0.05)，但这两组之间并无显著差异(P>0.05)。

图1 不同浓度IL-1β作用后MMP-13的相对mRNA表达

2.2 MMP-13蛋白的表达 选择10 ng/ml IL-1β作为最适浓度作用于hPDLFs 24 h后，MMP-13蛋白的表达为0.75±0.29，显著高于对照组的0.45±0.02(P<0.05)。

3 讨论

牙根吸收是正畸治疗过程中较为严重的并发症，目前主要通过轻力矫治、缩短疗程、定期的影像学观察进行预防，但始终缺乏一种主动的措施能够防止牙根吸收的发生。

IL-1是已知的介导炎性的细胞因子，可以诱导蛋白质发生急性或慢性炎症，AI-Qawasmi等[8]已经证实，IL-1β基因与牙根吸收的发生有着密切联系。Okamura等[9]通过原位杂交的方法，在牙根吸收的组织中也检测到IL-1 mRNA，并指出IL-1是增强牙根吸收的一个重要因子。研究显示[10]，牙根吸收与骨吸收比较类似，包括矿物质的溶解和有机质的降解，而基质金属蛋白酶是锌肽酶家族的一员，几乎可以降解细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)的所有成分。Delaisse等[11]的研究也确定，MMPs是细胞外基质降解的关键酶。MMP-13属于间质胶原酶，不仅降解牙周组织中最具特征的Ⅰ型胶原，激活MMP-9[12]，更能把胶原纤维进一步降解到更小的分子量，更加充分地降解细胞外基质。同时暴露有机质层下的矿物质；诱导分化及活化破骨细胞，从而导致根面破骨性吸收。Peeters-Joris等[13]的研究证实，与其他MMPs相比， MMP-13在骨基质降解过程中起了重要的作用。因此，MMP-13在牙根吸收中作为蛋白质酶发挥着重要作用，但这两者之间的联系究竟怎样呢？

本研究利用IL-1β作用于体外培养的hPDLFs，初步观察到IL-1β介导下MMP-13表达情况，且伴随IL-1β浓度增加，MMP-13的表达呈一定的正相关性。并使用10 ng/ml IL-1β作为最适浓度作用于hPDLFs 24 h后，提取细胞总蛋白进行检测，实验组与对照组比较，MMP-13的蛋白表达具有显著差异。该结论表明，在IL-1β介导下，MMP-13表达的增加可能是产生牙根吸收的原因之一。进一步提示，抑制IL-1β的活性，将可能有助于抑制牙根吸收。

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Research off effects of interleukin-1β on the expression of MMP-13 in human periodontal ligament fibroblasts

Yan Yan,Zhou Yun,Zhuang Rong,Cao Jun

Department of Orthodontics,the Dental Hospital of the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shanxi,710032,China

Objective To investigate the effects of interleukin-1β on the expression of matrix metalloproteinase-13(MMP-13)in human periodontal ligament fibroblasts(hPDLFs).Methods The hPDLFs isolated and cultuered in vitro were randomly divided into control and exprimental groups.Serum-free medium was added in the control group,while different concentration of IL-1β(0 ng/ml,0.5 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,and 20 ng/ml)was added in the exprimental groups to culture hPDLFs for 24 h.Then real-time PCR was used to detect the expression of MMP-13 mRNA,and the optimal concentration was selected to culture hPDLFs for 24 h.The changes of the expression of MMP-13 were detected by Western blot.Results Compared with the control group,the mRNA expression of MMP-13 in the experimental groups were most obvious when the concentration of IL-1β was 10 ng/ml and 20 ng/ml(P<0.05),but there was no significant difference of the expression between the concentration of 10 ng/ml and 20 ng/ml(P>0.05).The best concentration for the stimulus of IL-1β was 10 ng/ml.When hPDLFs were cultured with this concentration for 24 h,the MMP-13 protein expression increased significantly compared with that in the control group,and there were significant differences between the two groups(P<0.05).Conclusion Under the regulation of IL-1β,the expression of MMP-13 in hPDLFs significantly increases and has obvious concentration dependency.The increase of MMP-13 expression may be one of the most important mechanisms of dental root absorption during the orthodontic treatment.

matrix metalloproteinase-13;interleukin-1β;human periodontal ligament fibroblast

国家自然科学基金资助项目(81070870)

710032 西安，第四军医大学口腔医院正畸科

曹 军，E-mail:wykun@fmmu.edu.cn

R 781.4

A

1004-0188(2014)02-0120-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.002

2013-10-08)